Iroyin

O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Awọn sẹẹli akàn ti wa ni ọpọlọpọ awọn ọna ṣiṣe lati bori aapọn cellular ati tẹsiwaju lati ni ilọsiwaju.Amuaradagba kinase R (PKR) ati amuaradagba amuaradagba rẹ (PACT) jẹ awọn oludahun akọkọ ti o ṣe atẹle ọpọlọpọ awọn ami aapọn ti o yori si idinamọ ti afikun sẹẹli ati apoptosis.Sibẹsibẹ, ilana ti ipa ọna PACT-PKR ninu awọn sẹẹli alakan jẹ aimọ pupọ julọ.Nibi, a rii pe gigun ti kii ṣe ifaminsi RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ni ipa taara ninu idinamọ ti ipa ọna PACT-PKR ati ṣe igbega igbega sẹẹli alakan.Lilo ibojuwo iṣẹ ṣiṣe ti o tobi ti CRISPRi 971 lncRNA ti o ni akàn, a rii pe DARS-AS1 ni nkan ṣe pẹlu imudara ilọsiwaju sẹẹli alakan ni pataki.Nitoribẹẹ, DARS-AS1 knockout ṣe idiwọ ilọsiwaju sẹẹli ati igbega apoptosis sẹẹli alakan ni ọpọlọpọ awọn laini sẹẹli alakan ni vitro ati dinku idagbasoke tumo ni vivo ni pataki.Ni imọ-ẹrọ, DARS-AS1 sopọ taara si agbegbe imuṣiṣẹ PACT ati ṣe idiwọ ibaraenisepo PACT-PKR, nitorinaa idinku imuṣiṣẹ PKR, eIF2a phosphorylation, ati idilọwọ iku sẹẹli apoptotic.Ni ile-iwosan, DARS-AS1 ni a fihan ni gbogbogbo ni awọn aarun pupọ, ati ijuwe pupọ ti lncRNA yii jẹ itọkasi asọtẹlẹ ti ko dara.Iwadi yii ṣe alaye ilana-akàn kan pato ti ọna PACT-PKR nipasẹ DARS-AS1 lncRNA ati pese ibi-afẹde miiran fun asọtẹlẹ akàn ati itọju.
Agbara lati ṣe deede si aapọn jẹ ẹya pataki ti iwalaaye sẹẹli alakan ati afikun.Ilọsiwaju iyara ati awọn ami iyasọtọ ti iṣelọpọ ti akàn tente oke ni awọn agbegbe microenvironments ti o lagbara-aini ounjẹ, hypoxia, ati pH kekere-ti o le fa awọn ipa ọna ifihan iku sẹẹli.Dysregulation ti wahala-kókó Jiini bi p535, ooru mọnamọna awọn ọlọjẹ 6, 7, KRAS8, 9, ati HIF-110, 11, 12, 13 ti wa ni nigbagbogbo woye ni akàn, nitorina didi apoptosis ati igbega iwalaaye.
Protein kinase R (PKR) jẹ sensọ aapọn pataki ati subunit kinase ti eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), olutọsọna itumọ ti o sopọ mọ wahala cellular si iku sẹẹli.PKR ni akọkọ ti damo bi amuaradagba antiviral nipasẹ iṣawari ti RNA ti o ni ilopo meji (dsRNA) ajeji kan.Nigbati o ba mu ṣiṣẹ, PKR phosphorylates eIF2a lati dẹkun gbogun ti ati iṣelọpọ amuaradagba cellular14,15,16.PACT (protein activator PKR) ti jẹ idanimọ bi amuaradagba amuṣiṣẹpọ PKR akọkọ ni laisi dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Nipasẹ ibaraenisepo taara pẹlu PKR, PACT ṣe iyipada ọpọlọpọ awọn aapọn (ebin omi ara, peroxide tabi itọju arsenite) si PKR ati awọn ipa ọna ifihan isalẹ.Ni afikun si eIF2a phosphorylation, PACT-mediated PKR activation nfa ọpọlọpọ awọn iṣẹlẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu idahun aapọn, pẹlu ipo atunṣe atunṣe nipasẹ ọna PI3K / Akt24, imudara ibajẹ DNA ti o ni ilọsiwaju nipasẹ p5325,26 ati NF-κB27,28 Awọn ilana igbasilẹ, 29. Fi fun ipa pataki wọn ni idahun aapọn, afikun, apoptosis ati awọn ilana cellular bọtini miiran, PKR ati PACT n ṣe ileri awọn ibi-afẹde itọju fun ọpọlọpọ awọn arun, paapaa akàn30,31,32,33.Bibẹẹkọ, laibikita iṣẹ-ṣiṣe pleiotropic yii ati pataki ti ẹkọ ti ara, ilana ti iṣẹ PACT/PKR ninu awọn sẹẹli alakan ṣi ṣiyemeji.
Awọn lncRNA jẹ awọn iwe afọwọkọ ti o tobi ju 200 nucleotides ti ko si agbara ifaminsi amuaradagba.Niwọn igba ti gige-eti gbogbo awọn iṣẹ akanṣe ilana jiini ti ṣe idanimọ ẹgbẹẹgbẹrun awọn lncRNAs, 35,36 pupọ ni a ti ṣe lati ṣe alaye awọn iṣẹ ṣiṣe ti ibi wọn.Ara ti n dagba ti iwadii ti fihan pe lncRNAs ni ipa ninu ọpọlọpọ awọn ilana ti ibi37 pẹlu ilana ti inactivation X-chromosome38,39, imprint40, transcription41,42, translation43 ati paapaa idagbasoke alakan44,45,46,47.Awọn ijinlẹ wọnyi royin pe ọpọlọpọ awọn lncRNAs ni ipa ninu ọna PACT/PKR.Ọkan iru iwadi fihan pe lncRNA ASPACT ṣe idiwọ transcription PACT ati alekun idaduro iparun ti PACT mRNA.Awọn ijinlẹ miiran ti fihan pe lncRNA nc886 sopọ mọ PKR ati ṣe idiwọ phosphorylation rẹ49,50.Titi di isisiyi, lncRNA ti n ṣakoso imuṣiṣẹ PKR-alajaja PACT ko tii royin.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ti jẹ idanimọ bi oncogenic lncRNA51,52,53,54.Nipasẹ ilana ti miP-194-5p53, miP-12952 ati miP-532-3p51, DARS-AS1 ti han lati ṣe igbelaruge idagbasoke ti carcinoma cell kidirin sẹẹli ti o han gbangba, carcinoma tairodu ati carcinoma ẹdọfóró ti kii-kekere sẹẹli, lẹsẹsẹ.Tong ati awọn ẹlẹgbẹ tun rii pe DARS-AS1 ṣe igbelaruge ilọsiwaju myeloma nipasẹ mimu iduroṣinṣin ti amuaradagba 39 (RBM39) RNA-binding motif.Sibẹsibẹ, ko si awọn iwadii ti a ṣe lori boya lncRNA yii ni ipa ninu ilana imuṣiṣẹ PACT-PKR ati idahun aapọn ti awọn sẹẹli alakan.
Nibi, a ṣe iboju ipadanu-iwọn-iwọn-nla nipa lilo eto CRISPRi ati pinnu pe DARS-AS1 lncRNA n ṣe agbega ilọsiwaju ti ọpọlọpọ awọn iru awọn sẹẹli alakan.Ni afikun, a ti ṣe idanimọ ẹrọ pataki kan: DARS-AS1 sopọ taara si PACT, ṣe idiwọ PACT ati abuda PKR, ṣe idiwọ phosphorylation ti eIF2a, sobusitireti PKR kekere, ati nikẹhin ṣe idiwọ iku sẹẹli apoptotic.Ni ipari, iṣẹ wa ṣafihan DARS-AS1 lncRNA gẹgẹbi olutọsọna ti ipa ọna PACT-PKR ati ibi-afẹde ti o pọju fun itọju akàn ati asọtẹlẹ.
Awọn ijinlẹ profaili jiini nla ti ṣe idanimọ awọn ọgọọgọrun ti lncRNA ti o ni nkan ṣe pẹlu akàn.Sibẹsibẹ, iṣẹ wọn wa ni aimọ pupọ56.Lati ṣe idanimọ awọn oludije lncRNA ti o ni ileri ti o ni ipa ninu lilọsiwaju akàn, a ṣe iboju isonu-ti-iṣẹ fun idinku ti o dinku ni laini sẹẹli alakan awọ SW620 nipa lilo eto CRISPRi (Fig. 1a).Ẹya alailẹgbẹ ti SW480 ati SW620 awọn laini sẹẹli alakan ni pe wọn wa lati awọn èèmọ akọkọ ati atẹle ni alaisan kan.Eyi n pese afiwe ti o niyelori fun kikọ ẹkọ awọn ayipada jiini ni ilọsiwaju ti akàn oluṣafihan ilọsiwaju.Nitorinaa, a ṣe atupale awọn iwe afọwọkọ ti awọn laini sẹẹli alakan colorectal (SW480 ati SW620) ni lilo ilana RNA ati gba diẹ ninu awọn lncRNA iṣẹ ṣiṣe lati awọn iwe ti a tẹjade.Da lori awọn abajade wọnyi, a ṣe apẹrẹ ile-ikawe sgRNA kan ti o ni 7355 sgRNA oligos ti o fojusi awọn lncRNA ti o ni alakan 971 ati 500 sgRNA oligos ti ko ni idojukọ fun iṣakoso odi (Data Afikun 1).
Aṣoju sikematiki ti ibojuwo nipa lilo eto CRISPRi.b sgRNA imudara lẹhin iboju.Laini aami petele duro log2 (ayipada agbo) = ± 0.58.Laini aami inaro tọkasi iye p = 0.05.Awọn aami dudu ṣe aṣoju sgRNA ti kii ṣe ibi-afẹde (apẹrẹ bi NC).Awọn aami pupa jẹ awọn sgRNA ti o fojusi DARS-AS1.Awọn aami buluu jẹ awọn sgRNA ti o fojusi LINC00205, lncRNA oncogenic ti a ṣapejuwe tẹlẹ.iyipada agbo = (kika deede, ọjọ 17) / (kika deede, ọjọ 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown ṣe idiwọ idagbasoke sẹẹli.Awọn ifi aṣiṣe ṣe aṣoju ± iyatọ boṣewa ti awọn adanwo mẹta.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 t-igbeyewo akeko oni-meji.d DARS-AS1 ikosile ninu èèmọ (TCGA dataset).em Ikosile ti DARS-AS1 ni deede so pọ ati awọn ayẹwo tumo lati awọn alaisan ti o ni BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ati COAD, lẹsẹsẹ (TCGA dataset).p-iye ni a gba nipa lilo t-idanwo Ọmọ ile-iwe ti o ni asopọ meji.
Lẹhin ti iṣelọpọ plasmid ati iṣakojọpọ lentivirus, a ṣe iyipada laini sẹẹli alakan awọ dCas9-SW620 pẹlu ile-ikawe ti o wa loke ni awọn adanwo ikolu ominira mẹrin.Ilọpo ti akoran (MOI) fun awọn akoran wọnyi jẹ 0.1-0.3, ti o nfihan pe sẹẹli kọọkan le jẹ gbigbe pẹlu sgRNA kan nikan.Lẹhin awọn ọjọ 18 ti aṣa in vitro, profaili imudara ti awọn sgRNA ti ibi-afẹde dinku tabi pọ si lẹhin ibojuwo, lakoko ti nọmba awọn oligonucleotides iṣakoso ti ko ni idojukọ ko yipada ni afiwe si profaili iṣaju iṣaju, ti o nfihan pe ibi-afẹde wa ni oju-iboju-iboju kan to gaju. ìkàwé.Iresi.1b ati tabili afikun 1). LINC00205, eyi ti a ti sọ tẹlẹ lati ṣe igbelaruge akàn ẹdọfóró ati ilọsiwaju akàn ẹdọ58,59,60, ti a ṣe ayẹwo (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), ifẹsẹmulẹ igbẹkẹle ti ibojuwo yii (Fig. 1b). LINC00205, eyi ti a ti sọ tẹlẹ lati ṣe igbelaruge akàn ẹdọfóró ati ilọsiwaju akàn ẹdọ58,59,60, ti a ṣe ayẹwo (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), ifẹsẹmulẹ igbẹkẹle ti ibojuwo yii (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, ti a ti sọ tẹlẹ lati ṣe igbelaruge ilọsiwaju ti akàn ẹdọfóró ati akàn ẹdọ58,59,60, ni a yọkuro (log2 (iyipada iyipada) <-0.58, p-value <0.05), ti o jẹrisi agbara ti ibojuwo yii (Fig. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, ti a ti sọ tẹlẹ lati ṣe igbelaruge ẹdọfóró ati akàn ẹdọ ẹdọ58,59,60, ni a yọkuro (log2 (ayipada iyipada) <-0.58, p-value <0.05), ti o jẹrisi agbara ti ibojuwo yii (Fig. .1b).
Lara gbogbo awọn lncRNA ti a ṣe idanwo, DARS-AS1 tun ṣe ayẹwo, pẹlu awọn mẹta cognate sgRNA oligonucleotides dinku ni pataki lẹhin awọn ọjọ 18 ti aṣa, ni iyanju pe ikọlu ti lncRNA yii yorisi idinku ilọsiwaju akàn (Fig. 1b).Abajade yii tun ni atilẹyin nipasẹ itupalẹ MTS ni awọn sẹẹli alakan awọ ti o fihan pe oṣuwọn idagba ti awọn sẹẹli knockdown DARS-AS1 jẹ idaji idaji ni akawe si awọn sẹẹli iṣakoso (Figure 1c) ati pe o ni ibamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju ti ọpọlọpọ awọn iru akàn miiran.: ko o cell kidinrin akàn, tairodu akàn ati ti kii-kekere cell ẹdọfóró akàn51,52,53,55.Sibẹsibẹ, iṣẹ rẹ ati awọn ilana molikula ninu akàn colorectal ko wa ni iwadii.Nitorinaa, a yan lncRNA yii fun ikẹkọ siwaju.
Lati ṣe iwadi ikosile DARS-AS1 ninu awọn alaisan, a ṣe atupale ni kikun awọn ayẹwo tumo 10,327 lati iṣẹ akanṣe Genome Atlas (TCGA).Awọn abajade wa fihan pe DARS-AS1 ti ṣafihan pupọ ati ni pataki ni awọn sẹẹli ti o ni ilera ni ọpọlọpọ awọn èèmọ, pẹlu colon adenocarcinoma (COAD), carcinoma cell clear cell (KIRC), ati carcinoma kidirin papillary cell carcinoma (KIRP)..Pupọ pupọ (Ọpọtọ 1d ati Aworan Iyọnda. 1a, b). Onínọmbà ti awọn ayẹwo ilera ti o ni ilera / tumo siwaju sii jẹrisi ikosile ti o ga pupọ ti DARS-AS1 ninu awọn èèmọ ti carcinoma urothelial àpòòtọ (BLCA), kidirin kidirin ko cell carcinoma (KIRC), adenocarcinoma pirositeti (PRAD), carcinoma squamous cell ẹdọfóró (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), ẹdọfóró adenocarcinoma (LUAD), ẹdọ ẹdọ hepatocellular carcinoma (LIHC), kidirin kidirin papillary cell carcinoma (KIRP), ati colon adenocarcinoma (COAD) (p iye <0.05) (Fig. 1e-m) . Onínọmbà ti awọn ayẹwo ilera ti o ni ilera / tumo siwaju sii jẹrisi ikosile ti o ga pupọ ti DARS-AS1 ninu awọn èèmọ ti carcinoma urothelial àpòòtọ (BLCA), kidirin kidirin ko cell carcinoma (KIRC), adenocarcinoma pirositeti (PRAD), carcinoma squamous cell ẹdọfóró (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), ẹdọfóró adenocarcinoma (LUAD), ẹdọ ẹdọ hepatocellular carcinoma (LIHC), kidirin kidirin papillary cell carcinoma (KIRP), ati colon adenocarcinoma (COAD) (p iye <0.05) (Fig. 1e-m) .Onínọmbà ti awọn ayẹwo ilera ti a so pọ / tumo tun jẹrisi ikosile ti o ga pupọ ti DARS-AS1 ni carcinoma urothelial àpòòtọ (BLCA), kidirin sẹẹli mimọ ati carcinoma kidirin sẹẹli (KIRC), adenocarcinoma pirositeti (PRAD), awọn èèmọ squamous cell carcinoma (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometrial carcinoma ti corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma ti ẹdọfóró (LUAD), hepatocellular carcinoma ti ẹdọ (LIHC), papillary cell carcinoma ti awọn kidinrin (KIRP), ati adenocarcinoma ti colon (COAD) (p iye < 0.05) (aworan 1e- m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 的 进一步 进一步 证实 证实 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 上 上 上 上 上 上 上 上 上 上 上 上 上 透明 透明 透明 透明 透明 透明 透明 透明 透明 透明 (KRISC), 肺鳞状 细胞癌 (Lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 高, 子宫体子宫 内膜 内膜 内膜 (ucec), 肺腺癌 (Luh), 肾 肾 细胞癌 细胞癌 (kirp) 和结肠腺癌 (Kirp) (P <0.05) (1e-m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 高 高 高 高 高 高 表达 高 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 ((ulce) 肺腺癌 (Luad) 肾 肾 肾 细胞癌 (kirp) (coad) (p 值 <0.05) (图1e-m) .Onínọmbà ti awọn ayẹwo ti o ni ilera / tumo si tun ṣe atilẹyin ipa ti DARS-AS1 ninu carcinoma urothelial àpòòtọ (BLCA), carcinoma cell renal cell carcinoma (KIRC), adenocarcinoma prostate prostate (PRAD), ati ẹdọfóró squamous cell carcinoma (LUSC) èèmọ.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ikosile ninu carcinoma uterine corpus (UCEC), adenocarcinoma ẹdọfóró (LUAD), carcinoma hepatocellular (LIHC), carcinoma papillary cell renal (KIRP), ati adenocarcinoma colon (COAD) (p iye <0.05) (Figure 1e -m).Papọ, awọn abajade wọnyi tọka pe DARS-AS1 wa ni ibigbogbo ati pe o ṣafihan pupọ ni ọpọlọpọ awọn aarun.
Nitori DARS-AS1 ati DARS (jiini ti n yipada okun antisense) pin olupolowo kanna ati pe o wa lẹgbẹẹ ara wọn, a ṣe apẹrẹ shRNA lati kọlu DARS-AS1 ni pataki ṣugbọn kii ṣe DARS (Afikun Apọju. 2a,b ati Tabili Imudara 2) .Ni afikun si SW620, a tun lo awọn laini sẹẹli mẹta miiran ti n ṣalaye gaan DARS-AS1 lati ṣe iwadi ipa ati iṣẹ ti knockdown shRNA (Tabili Imudara 3).Awọn abajade wa tọka si pe gbogbo awọn shRNA mẹta ti dagbasoke ni aṣeyọri o kere ju 80% DARS-AS1 ṣiṣe knockdown pẹlu ipa kekere lori iye DARS mRNA (Afikun Apọju. 2c–f).Ni afikun, a rii pe DARS-AS1 knockdown pẹlu awọn shRNA wọnyi ṣe idiwọ idagbasoke sẹẹli ni pataki ni awọn laini sẹẹli alakan awọ SW620 (49.7%) ati HCT116 (27.7%), laini sẹẹli alakan igbaya MBA-MD-231 (53.4%).) ati HepG2 hepatoma cell line (92.7% idinku), bakannaa agbara wọn lati ṣe awọn aaye ti a ko ni idinamọ (idinku apapọ ti ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ati 75.7% fun laini sẹẹli) (Fig. 2a,b).Ni SW620, awọn abajade ti iṣelọpọ ileto siwaju sii jẹrisi pe DARS-AS1 shRNA ṣe idiwọ ilọsiwaju sẹẹli ni pataki pẹlu idinku aropin ti isunmọ 69.6% (Fig. 2c).
Ipa ti iṣakoso shRNA ati DARS-AS1 shRNA lori ilọsiwaju sẹẹli (a) ati iṣeto spheroid (b) ni SW620, HCT116, MBA-MD-231, ati awọn sẹẹli HepG2.c Ipa iṣakoso shRNA ati DARS-AS1 shRNA lori iṣelọpọ ileto ni awọn sẹẹli SW620.Ilọsiwaju sẹẹli (d), didasilẹ spheroid (e), ati didasilẹ ileto (f) ti awọn sẹẹli SW620 ti o nfi DARS-AS1 pupọju.Awọn data ti o han jẹ iyatọ ± boṣewa ti awọn adanwo mẹta.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ati *** p ≤ 0.001 nipasẹ t-igbeyewo Akeko-meji.
Lati ṣe iranlowo awọn ẹkọ-pipadanu iṣẹ-ṣiṣe, nigbamii ti a ṣẹda awọn sẹẹli SW620 ti o pọju DARS-AS1 (Fig. 2g Afikun).DARS-AS1 overexpression ṣe alekun idagbasoke sẹẹli (1.8-fold), dida spheroid ti ko nii (1.4-fold), ati iṣelọpọ ileto (3.3-fold) ni awọn sẹẹli SW620 (Fig. 2d – f).A jẹrisi abajade yii nipa lilo laini sẹẹli ti n ṣalaye DARS-AS1 miiran, A549.Ilọsiwaju sẹẹli ti o ni ilọsiwaju nitori DARS-AS1 overexpression ni a ṣe akiyesi siwaju sii ni awọn sẹẹli A549 (Afikun.Papọ, awọn ere wọnyi ati awọn ijinlẹ ipadanu fihan pe DARS-AS1 ṣe agbega ilọsiwaju sẹẹli alakan ni vitro.
Lati ṣawari ẹrọ ti o wa ni ipilẹ nipasẹ eyiti DARS-AS1 ṣe ilana imugboroja sẹẹli, a ṣe ayẹwo RNA fa-isalẹ lati ṣe idanimọ awọn alabaṣiṣẹpọ amuaradagba ti o pọju.Awọn abajade RT-qPCR fihan pe nipa 86.2% ti DARS-AS1 wa ninu cytoplasm ti awọn sẹẹli SW620 (Eya afikun 3a).In vitro transcribed biotinylated DARS-AS1 tabi pseudoRNA ti wa ni idabo pẹlu SW620 cell lysates atẹle nipa SDS-PAGE Iyapa.Abawọn fadaka ti o tẹle fihan pe ẹgbẹ kan pato (~ 38 kDa) ti ni idarato ni pataki ni awọn ayẹwo fa DARS-AS1 ṣugbọn kii ṣe ni RNA dummy tabi awọn apẹẹrẹ awọn ilẹkẹ (Fig. 3a).A ṣe idanimọ ẹgbẹ yii bi amuaradagba ti n ṣiṣẹ PKR (PACT) nipasẹ spectrometry pupọ (MS) ati siwaju sii timo nipasẹ immunoblotting ni SW620, HCT116, ati awọn laini sẹẹli HepG2 (Fig. 3a,b).Imudara ti DARS ati awọn ọlọjẹ PACT ti o ni ibatan - PKR ati TRBP - tun ṣe iwadii nipa lilo itupalẹ RNA nipasẹ Western blotting (WB).Awọn abajade fihan pe ko si ibaraenisepo taara laarin DARS-AS1 RNA ati awọn ọlọjẹ mẹta wọnyi ti a rii (Eyaworan 3b afikun).Ibaraẹnisọrọ kan pato laarin DARS-AS1 ati PACT ni a fọwọsi siwaju nipasẹ itupalẹ imunoprecipitation RNA (RIP), eyiti o fihan pe DARS-AS1 ti ni idarato ni pataki ni awọn ọlọjẹ anti-PACT ṣugbọn kii ṣe awọn RNA iṣakoso miiran (Nọmba 3c).Lati pinnu boya DARS-AS1 ṣe ajọṣepọ taara pẹlu PACT ni isansa ti eyikeyi awọn paati cellular miiran, idanwo in vitro bilayer interferometry (BLI) ni a ṣe ni lilo PACT ti a sọ di mimọ.Biotin-aami-ara DARS-AS1 tabi dummy RNA jẹ aibikita lori awọn sensọ biosensors streptavidin (SA) ati lẹhinna ni idawọle ninu ifipamọ kainetik ti o ni 1 μM PACT ninu.Ni pataki, PACT ni asopọ ni agbara si DARS-AS1 (iye KD ~ 26.9 nM), ṣugbọn kii ṣe lati farawe RNA (Aworan 3d).Papọ, awọn abajade wọnyi ṣe afihan ibaraenisepo taara ati isunmọ giga laarin DARS-AS1 ati PACT.
Ayẹwo fa RNA ṣe idanimọ DARS-AS1 ni ibaraenisepo pẹlu PACT ni awọn sẹẹli SW620.Loke, fifọ fadaka ti awọn ọlọjẹ ti o ni ibatan.Awọn ajẹsara kekere ni a ṣe pẹlu egboogi-PACT antibody.b RNA fa-isalẹ onínọmbà ti a ṣe ni HCT116 (oke) ati HepG2 (isalẹ) awọn sẹẹli.Imudara PACT ni a rii nipasẹ ajẹsara.Awọn idanwo ajẹsara ajẹsara cRNA (RIP) ni a ṣe ni awọn sẹẹli SW620 nipa lilo awọn egboogi ti a tọka.d PACT abuda ìsépo to ni kikun-ipari DARS-AS1 tabi iṣakoso RNA won gba lilo bilayer interferometry (BLI).RNA jẹ aibikita lori biosensor streptavidin kan.1 μM PACT ni a lo lati wiwọn ẹgbẹ.e RNA fa assay ti a ṣe nipa lilo biotinylated ni kikun-ipari DARS-AS1 tabi truncated (oke).Immunoblot ti nfihan PACT ti gba (isalẹ).f PACT ti asia ti a sọ di mimọ jẹ idawọle pẹlu biotinylated ni kikun-gigun DARS-AS1 tabi gedu (bi ninu e) fun in vitro RIP assay.RNA ti o jade jẹ iṣeduro nipasẹ RT-qPCR.g Ibaṣepọ ibatan ti awọn ajẹkù RNA oriṣiriṣi fun PACT ni a gba ni lilo interferometry bilayer.Fun itupalẹ, 100 nM RNA ati 1 μM RAST ni a lo.h In vitro RIP assays ni a ṣe ni lilo imule mimọ tabi ti a fi aami si PACT.RNA ti o jade jẹ iṣeduro nipasẹ RT-qPCR.i Oṣuwọn Idagba ti awọn sẹẹli SW620 ti n ṣalaye DARS-AS1, PACT, tabi mejeeji.j Overexpression ti ipari-kikun tabi gedu DARS-AS1 ni awọn sẹẹli SW620 ni awọn ipa oriṣiriṣi lori idagbasoke sẹẹli.k Apoptosis jẹ wiwa nipasẹ ajẹsara ajẹsara pẹlu egboogi-PARP.l Knockout ti DARS-AS1 nfa apoptosis ti awọn sẹẹli SW620 bi a ṣe han nipasẹ cytometry sisan.Awọn data ti o han jẹ iyatọ ± boṣewa ti awọn adanwo mẹta. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, nipasẹ idanwo t akeko meji-tailed. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, nipasẹ idanwo t akeko meji-tailed. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 pо двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 nipasẹ t-igbeyewo Omo ile-meji. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 pо двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 nipasẹ t-igbeyewo Omo ile-meji.
Lẹhinna a ṣe ipilẹṣẹ awọn ajẹkù DARS-AS1 RNA biotinylated mẹta nipasẹ transcription in vitro lati ṣe idanimọ agbegbe DARS-AS1 ti o nilo fun ẹgbẹ PACT (Aworan 3e).Awọn abajade itupalẹ RNA fihan pe ajẹkù kọọkan ni anfani lati ṣe ajọṣepọ pẹlu PACT, ṣugbọn agbegbe 3′-terminal (384-768 nucleotides ti a samisi A3) fihan diẹ sii ju 1-384 nucleotides ti a samisi A1) (Fig. 3e).Awọn abajade ti o jọra ni a ṣe akiyesi ni idanwo in vitro RIP nipa lilo PACT recombinant (Aworan 3f).Ni ibamu pẹlu awọn abajade wọnyi, awọn adanwo lati di awọn ajẹkù RNA ti a ko le yipada si PACT nipa lilo BLI tun fihan pe PACT ni ibatan ti o ga julọ fun A3 (384-768 nt) (iye KD ti isunmọ 94.6 nM), lakoko ti o fẹrẹ ko si awọn ọna asopọ pẹlu awọn agbegbe miiran.(Eya. 3d).
A tun ṣe ayẹwo awọn agbegbe abuda ti o somọ ni PACT.PACT ni awọn ibugbe iṣẹ ṣiṣe mẹta, meji ninu eyiti o jẹ titọju awọn ibugbe RNA-abuda-meji (dsRBD) ati agbegbe kẹta (D3 ti a yan) ti o ṣe bi olufisi awọn ibaraenisepo amuaradagba.Lati ṣe ayẹwo agbara abuda lncRNA ti agbegbe kọọkan, a ṣe adaṣe awọn iyipada mẹta ti o yọ ọkọọkan awọn agbegbe mẹta naa kuro ati ṣe idanwo RIP in vitro kan.Awọn abajade wa fihan pe piparẹ ti agbegbe kẹta (D3) ti PACT ṣe pataki dinku ibaraenisepo rẹ pẹlu DARS-AS1 (nipasẹ 0.11-agbo ti a fiwewe pẹlu PACT ti ko tọ) ni akawe si awọn iyipada meji miiran (Fig. 3h), o han pe itusilẹ naa. ti D3 ibaraenisepo pẹlu DARS.-AC1.Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe ibaraenisepo laarin DARS-AS1 ati PACT le waye ni akọkọ nipasẹ opin 3′ ti DARS-AS1 ati agbegbe D3 ti PACT.
A ṣe akiyesi pe DARS-AS1 ko ni ipa lori ikosile PACT ati PACT ko ni ipa lori DARS-AS1 (Afikun 3c).Lẹhinna a ṣe ayẹwo ipa ti ikọlu PACT lori idagbasoke sẹẹli.Ni idakeji si DARS-AS1, awọn sẹẹli ibatan dagba 1.5-3 igba yiyara nigbati PACT ti lulẹ (Afikun 3d).Awọn abajade ti iṣeduro iṣelọpọ ileto fihan pe awọn sẹẹli ti o ṣẹda awọn ileto 2-3-agbo lẹhin itọju shRNA pẹlu PACT (Afikun Fig. 3e).Lati ṣe idanwo boya DARS-AS1 ṣe ilana imugboroja sẹẹli nipasẹ PACT, a ṣe ipilẹṣẹ awọn sẹẹli SW620 ti o pọju PACT, DARS-AS1, tabi mejeeji.Overexpression ti PACT ṣe afihan idinamọ pataki ti ilọsiwaju sẹẹli (Figure 3i).Lakoko ti DARS-AS1 overexpression fun se pataki ni igbega igbega sẹẹli, ko si iyatọ nla ninu iwọn idagba ti awọn sẹẹli ti n ṣalaye DARS-AS1 ati PACT.Awọn abajade wọnyi daba pe PACT le koju ilodisi ti o pọ si ti o ṣẹlẹ nipasẹ ijuwe ti DARS-AS1.
Niwọn igba ti awọn oriṣiriṣi awọn agbegbe ti DARS-AS1 ni awọn agbara abuda PACT ti o yatọ, a ṣe iwadii ipa ibatan wọn lori isunmọ sẹẹli nipasẹ iwọn apọju pupọ ti awọn ajẹkù DARS-AS1.Ti a bawe si awọn ajẹkù meji miiran, DARS-AS1 ti ni ilọsiwaju pupọ ni 3 'ipari (384-768 nt), agbegbe akọkọ ti o ni ibatan PACT ni DARS-AS1, ti o ni agbara ti o ga julọ lati mu ilọsiwaju sẹẹli (Fig. 3j).Awọn abajade wọnyi ṣe afihan ibaramu rere laarin agbara abuda ati iṣẹ ti ibi ti DARS-AS1.
PACT ti royin pe o jẹ amuaradagba pro-apoptotic19.Nitorinaa, a ṣe iwadii ipa ti DARS-AS1 lori apoptosis.Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, DARS-AS1 knockdown ṣe pataki pọ si pipin PARP ni awọn sẹẹli SW620 ati pe o pọ si ti awọn sẹẹli annexin V-positive ni SW620, HCT116, HepG2, ati MBA-MD-231 awọn laini sẹẹli (Fig. 3k).3).3f-h), ti o nfihan pe ipa anti-apoptotic ti DARS-AS1 ninu awọn sẹẹli alakan jẹ idakeji si iṣẹ-ṣiṣe apoptosis-inducing ti PACT.Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe ẹrọ ti DARS-AS1 iṣẹ oncogenic le jẹ nipasẹ idinamọ iṣẹ PACT.
Nigbamii ti, a ṣawari awọn iṣẹ ṣiṣe ti DARS-AS1-PACT.PACT ti ni ijabọ lati mu PKR ṣiṣẹ nipasẹ ibaraenisepo taara, eyiti o ṣe imudara eIF2a phosphorylation, nfa piparẹ itumọ ati apoptosis17.Ni akọkọ, a ṣe ayẹwo boya DARS-AS1 ni ipa lori agbegbe cellular ti PACT ati PKR.Alakirosikopu Confocal fluorescence fihan pe PACT ati PKR ni a sọ di pupọ ni awọn sẹẹli SW620 pẹlu arosọpọ ibamu ibamu Pearson ti 0.72.Nibayi, DARS-AS1 overexpression significantly dinku PACT ati PKR co-localization (tumọ si Pearson coefficient coefficient 0.61) (Figure 4a).Lati ṣe iwadii boya DARS-AS1 le ṣe atunṣe ibaraenisepo PACT-PKR, a ṣe ayẹwo ajẹsara ajẹsara (co-IP) pẹlu egboogi-PACT antibody ni SW620 cell lysates.PKR ti ni ilọsiwaju pupọ ni egboogi-PACT ninu awọn sẹẹli iṣakoso, lakoko ti imularada PKR dinku ni pataki ni awọn lysates lati awọn sẹẹli ti o nfi DARS-AS1 (Fig. 4b).PaCT ti a sọ di mimọ ati PKR ni a lo fun awọn igbelewọn abuda amuaradagba in vitro.Nitorinaa, awọn ti o pese DARS-AS1 ṣugbọn ko si iṣakoso RNA ṣe afihan ibaraenisepo PACT-PKR ti tẹmọlẹ (Aworan 4c).Gbogbo awọn abajade fihan pe DARS-AS1 dabaru PACT ati ibaraẹnisọrọ PKR.
Iṣọkan-agbegbe ti PACT ati PKR ninu awọn sẹẹli iṣakoso tabi awọn sẹẹli ti o ṣe afihan DARS-AS1 ni a ṣe akiyesi nipa lilo microscopy fluorescence confocal.Awọn ekuro ti ni abawọn pẹlu DAPI.Awọn abajade iṣiro ni a gba lati awọn fọto 16.b Co-immunoprecipitation (àjọ-IP) lilo egboogi-PACT antibody ni cell lysates ti Iṣakoso SW620 ẹyin tabi awọn sẹẹli overexpressing DARS-AS1.c Aami PACT, PKR ti a sọ di mimọ ati ti a kọ sinu vitro pẹlu DARS-AS1 tabi mock RNA ti wa ni idawọle fun itupalẹ abuda amuaradagba in vitro.Awọn aporo-ara ti o lodi si asia ni a lo fun ajẹsara.d Immunoblots pẹlu awọn egboogi ti a fihan ni a ṣe ni SW620 ati awọn sẹẹli HCT116 ti o yipada pẹlu iṣakoso shRNA tabi DARS-AS1-shRNA ti o tẹle pẹlu ebi omi ara.Awọn ipele ikosile DARS-AS1 yipada ifamọ cellular si thapsigargin.Awọn sẹẹli SW620 ti yipada pẹlu DARS-AS1 shRNA, plasmid overexpression DARS-AS1 tabi plasmid iṣakoso.A ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu thapsigargin fun awọn wakati 48 ati ṣiṣeeṣe sẹẹli ti pinnu nipa lilo reagent MTS.f In vitro transcrited DARS-AS1 tabi dummy RNA ati PACT ti a sọ di mimọ ni a lo fun idanwo imuṣiṣẹ in vitro ati wiwa immunoblot.g Immunoblots ni lilo awọn aporo-ara wọnyi ni a ṣe lori awọn sẹẹli SW620-ctrl (osi) tabi awọn sẹẹli ti o njade pupọ awọn ẹda PKR (ọtun).Awọn sẹẹli wọnyi lẹhinna yipada pẹlu iṣakoso shRNA tabi DARS-AS1-shRNA ti o tẹle pẹlu ebi omi ara.h Sitometry ṣiṣan fihan pe aiṣiṣẹ ti mutant PKR sanpada fun apoptosis ti o fa DARS-AS1 ni awọn sẹẹli SW620.Immunoblots pẹlu awọn egboogi ti a fihan ni a ṣe ni SW620 (osi) tabi awọn sẹẹli HCT116 (ọtun).Awọn sẹẹli ti a ti yipada pẹlu iṣakoso shRNA tabi DARS-AS1 shRNA jẹ aibikita omi-ara ati afikun pẹlu 100 nM PKR C16 inhibitor tabi DMSO.Pẹpẹ iwọn = 5 µm.Awọn data ti o han jẹ iyatọ ± boṣewa ti awọn adanwo mẹta.* p ≤ 0.05 t-igbeyewo akeko oni-meji.
O gbagbọ ni gbogbogbo pe ni kete ti PACT ba ṣe ajọṣepọ pẹlu PKR17, PKR phosphorylation ni Thr451 le fa.Awọn abajade wa fihan pe ipele ti PKR phosphorylation ti ga ni pataki ni awọn sẹẹli knockdown DARS-AS1 lẹhin ebi omi ara (Fig. 4d ati Apọju Apọju. 4a).Nitorinaa, a rii pe phosphorylation ti eIF2a, sobusitireti PKR akọkọ, tun pọ si ni pataki nipasẹ DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ati Apọju Apọju. 4a).Thapsigargin jẹ aapọn ER ti o fa ki ER tu Ca2+ silẹ.Itọju pẹlu thapsigargin ni a ti royin lati fa ikosile ati imuṣiṣẹ ti PACT, eyiti o tun ṣe ajọṣepọ pẹlu ati mu PKR ṣiṣẹ, ti o yori si apoptosis nipasẹ jijẹ eIF2α phosphorylation 18,61.Nibi, a lo thapsigargin gẹgẹbi olutọpa ti ipa ọna PACT/PKR lati ṣe iwadii boya DARS-AS1 le ṣe iranlọwọ fun awọn sẹẹli bori aapọn nipa didi ipa ọna PACT/PKR.A ṣe akiyesi pe ipele ti ikosile DARS-AS1 daadaa ni ibamu pẹlu resistance sẹẹli si thapsigargin.Awọn sẹẹli SW620 overexpressing DARS-AS1 yege daradara nigba itọju pẹlu thapsigargin, lakoko ti awọn sẹẹli pẹlu DARS-AS1 knockdown di ifaragba diẹ sii (Fig. 4e).Ni ibamu pẹlu awọn abajade wọnyi, DARS-AS1 overexpression dinku thapsigargin-induced PKR phosphorylation (Afikun Fig. 4b).Ni idakeji, lẹhin itọju thapsigargin, PKR ati eIF2a jẹ phosphorylated si iwọn ti o ga julọ ni awọn sẹẹli DARS-AS1 knockdown ti a fiwe si awọn sẹẹli iṣakoso (Afikun Fig. 4b).O yanilenu, thapsigargin ṣe afihan ikosile DARS-AS1 ni ọna ti o gbẹkẹle iwọn lilo, eyiti o le ṣe afihan iṣẹ-iṣoro aapọn ti DARS-AS1 (Eya afikun 4c).Ni afikun, a ṣe awọn idanwo imuṣiṣẹ in vitro lati jẹrisi awọn akiyesi wọnyi.Ni ṣoki, PKR jẹ mimọ lati awọn lysates sẹẹli nipa lilo egboogi-PKR antibody, lẹhinna ni idapọ pẹlu PACT recombinant ati DARS-AS1 ti a kọ sinu vitro.Lẹhin iṣesi enzymatic, phospho-PKR ti wa ni lilo WB.Awọn abajade wa fihan pe PKR phosphorylation jẹ idinamọ ni pataki nipasẹ DARS-AS1, ṣugbọn kii ṣe nipasẹ iṣakoso RNA (Figure 4f).Iwọnyi in vitro ati awọn abajade vivo ni imọran pe DARS-AS1 ṣe idiwọ imuṣiṣẹ PKR-ilaja PACT.Ni akoko kanna, a tun ṣe akiyesi idinku ninu imularada PACT ni iwaju DARS-AS1 (Figure 4f).Abajade yii wa ni ibamu pẹlu awọn abajade ti iṣiro abuda amuaradagba in vitro (Nọmba 4c) ati tun ṣe apejuwe iṣẹ idinamọ ti DARS-AS1 fun ẹgbẹ PACT-PKR.
Ser246 ati Ser287 ni agbegbe D3 ti PACT ni a nilo fun imuṣiṣẹ PKR labẹ aapọn cellular.Fidipo awọn iṣẹku serine meji fun alanine funni mutant PACT (mutD), eyiti o mu PKR ṣiṣẹ ni laisi wahala, ati iyipada fun alanine (mutA) yiyipada ilana naa.Niwọn bi a ti ṣe afihan pataki ti agbegbe yii ni ajọṣepọ taara pẹlu DARS-AS1, a ṣe ipilẹṣẹ awọn ẹda PACT meji wọnyi lati ṣe idanwo boya awọn iṣẹku wọnyi tun le ni ipa ninu ibaraenisepo pẹlu DARS-AS1.O yanilenu, mejeeji mutanti padanu agbara lati sopọ si DARS-AS1 (Afikun 4d), ni iyanju pe eto pipe ti amuaradagba PACT le nilo fun ibaraenisepo daradara pẹlu DARS-AS1.
Pẹlupẹlu, awọn abajade wa tun daba pe idinamọ ti DARS-AS1-shRNA-induced of cell proliferation le ti wa ni mu pada ni apakan nipa overexpressing kan ti o pọju PACT mutant (PACTmutA) tabi kan ti o pọju PKR mutant (PKRmut) (Afikun Fig. 4e. e).Overexpression ti ako-negative PKR mutanti dinku PKR phosphorylation induced nipasẹ DARS-AS1 knockdown bi daradara bi eIF2a phosphorylation ni serum-deprised ẹyin (Fig. 4g).Ti o ṣe pataki julọ, ipin ti awọn sẹẹli apoptotic ti o fa nipasẹ DARS-AS1 knockdown tun dinku ninu awọn sẹẹli ti o pọju PKRMut (Fig. 4h ati Fig. 4g).Idena iṣẹ PKR kinase tun ṣe ipalara iṣẹ DARS-AS1, bi awọn esi ti fihan pe DARS-AS1 knockdown ṣọwọn nfa PKR ati eIF2a phosphorylation nigba ti a ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu PKR-pato C16 inhibitor (Fig. 4i ati Afikun Fig. 4h).).Ti a mu papọ, awọn abajade wa daba pe DARS-AS1 n ṣe agbega ilọsiwaju sẹẹli, o kere ju ni apakan, nipa idinamọ imuṣiṣẹ PKR ti o ni agbedemeji PACT.
Lati ṣawari siwaju si ipa ti DARS-AS1 ninu tumorigenesis, a ṣe ni awọn idanwo vivo nipa lilo awoṣe xenograft Asin kan. Awọn abajade fihan pe ikọlu ti DARS-AS1 dinku pupọ idagbasoke tumo ninu awọn eku (p iye <0.0001) (Fig. 5a). Awọn abajade fihan pe ikọlu ti DARS-AS1 dinku pupọ idagbasoke tumo ninu awọn eku (p iye <0.0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. Awọn abajade fihan pe DARS-AS1 knockdown dinku dinku idagbasoke tumo ninu awọn eku (p iye <0.0001) (Figure 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (5). Awọn abajade fihan pe DARS-AS1 knockdown dinku pataki idagbasoke tumo ninu awọn eku (p iye <0.0001) (Figure 5a).Nitorinaa, ninu ẹgbẹ knockdown DARS-AS1, idinku nla wa ni iwọn iwọn tumo iwọn nipa iwọn 72.9% ati tumọ si ibi-iṣan tumo nipasẹ nipa 87.8% (Figure 5b-d).Awọn abajade wọnyi daba ni iyanju pe DARS-AS1 le ṣe igbelaruge idagbasoke tumo ni pataki ni vivo.
Awọn ipa ti ipolowo DARS-AS1 knockdown lori colorectal oncogenesis ninu awọn eku ihoho.Awọn igun idagbasoke (a), iwọn tumo (b), iwuwo (c), ati awọn aworan tumo (d) ti han.Awọn ọpa aṣiṣe ṣe aṣoju ± SEM. n = 10. ****p <0.0001, nipasẹ idanwo t ọmọ-ẹgbẹ meji. n = 10. ****p <0.0001, nipasẹ idanwo t ọmọ-ẹgbẹ meji. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 t-igbeyewo akeko oni-meji.n = 10. ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 t-igbeyewo akeko oni-meji.e Kaplan-Meier ṣe atupale ibamu laarin awọn ipele ikosile DARS-AS1 ati iwalaaye gbogbogbo ni awọn alaisan pẹlu UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ati LGG.Awọn ipele giga ti DARS-AS1 ikosile ni awọn alaisan wa ni oke 50%;ipele kekere ti ikosile DARS-AS1 ni awọn alaisan wa ni isalẹ 50%.p-iye ti pinnu nipa lilo idanwo ipo log.f Awoṣe ti a dabaa ninu eyiti DARS-AS1 ṣe ilana ipa ọna PACT-PKR ati idagbasoke tumo.
Lati ni oye daradara ni ipa ile-iwosan ti DARS-AS1, a ṣe ayẹwo ibamu laarin ikosile rẹ ati iwalaaye alaisan.Nipa itupalẹ dataset TCGA, a rii pe ikosile DARS-AS1 ti o ga julọ ni nkan ṣe pẹlu uveal melanoma (UVM), chromophobia kidirin (KICH), carcinoma kidirin papillary cell (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Iwalaaye isalẹ jẹ pataki ni nkan ṣe pẹlu morphosis glioblastoma (GBM) ati awọn alaisan ti o ni glioma ọpọlọ-kekere (LGG) (Figure 5e).Awọn abajade wọnyi daba pe DARS-AS1 le ṣe ipa pataki ninu ilọsiwaju tumor ile-iwosan ati pe o le jẹ alamọ-ara ti o ni imọran ti o pọju ni awọn aarun pupọ.
Ninu iwadi yii, ni lilo ibojuwo iṣẹ CRISPRi ti o tobi, a pinnu pe DARS-AS1 lncRNA bori aapọn sẹẹli alakan nipasẹ ṣiṣe ilana awọn oludahun wahala bọtini meji, PACT ati PKR.Nipa ibaraenisọrọ taara pẹlu PACT, DARS-AS1 ṣe idiwọ imuṣiṣẹ PKR ti o ni agbedemeji PACT, nitorinaa idilọwọ iku sẹẹli apoptotic ati igbega igbega sẹẹli (Fig. 5f).Imudarasi ti DARS-AS1 ni a ti ṣe akiyesi ni ọpọlọpọ awọn oriṣi ti akàn, ni iyanju pe iṣẹ rẹ ti igbega iwalaaye sẹẹli alakan labẹ awọn ipo aapọn le wulo ni gbooro si awọn iru akàn pupọ.
A ti ṣe idanimọ PACT bi amuaradagba amuṣiṣẹpọ PKR, ati imuṣiṣẹ PKR ti o ni agbedemeji PACT ṣe ipa pataki ninu awọn idahun aapọn nipasẹ ṣiṣe ilana transcription, itumọ, apoptosis, ati awọn ilana cellular pataki miiran62.Fun ewadun, awọn igbiyanju ti ṣe lati loye ilana-akàn kan ti kasikedi PACT-PKR.Nibi, iwadi wa ṣafihan ilana ti o yatọ ti ilana ti PACT-PKR ninu awọn sẹẹli alakan nipasẹ cellular lncRNA DARS-AS1, eyiti o sopọ taara si PACT, ṣe idiwọ ibaraenisepo PACT-PKR, ṣe idiwọ imuṣiṣẹ PKR ati eIF2a phosphorylation, nitorinaa ṣe idiwọ apoptosis ti o fa wahala ati safikun eventual akàn afikun.awọn sẹẹli.Awari yii tan ina sori awọn ibi-afẹde lncRNA ti o pọju fun asọtẹlẹ alakan ati itọju ailera.
Awọn data wa fihan pe DARS-AS1 knockdown ṣe akiyesi awọn sẹẹli si ebi omi ara pẹlu ilosoke pataki ninu PKR phosphorylated ati eIF2a.Awọn abajade wọnyi daba pe DARS-AS1 ṣe agbega iwalaaye sẹẹli alakan labẹ awọn ipo lile nipasẹ didina iṣẹ PACT/PKR.Ọpọlọpọ awọn RNA miiran ti kii ṣe ifaminsi, gẹgẹbi ASPACT ati nc886, tun ni ipa ninu ipo PACT/PKR nipasẹ didari PACT48 mRNA tabi ṣiṣakoso autophosphorylation nipasẹ didimu si PKR49,50,64.Lara wọn, DARS-AS1 n ṣiṣẹ bi idalọwọduro ti ẹgbẹ PACT-PKR.Iwadi yii ṣe alekun oye wa ti ilana aṣisi PACT/PKR ati ipa ti awọn lncRNA ninu awọn idahun wahala.
PACT ni awọn ibugbe lọtọ mẹta.Ọkọọkan awọn dsRBD meji akọkọ ti to lati ṣaṣeyọri ifaramọ ibaramu giga ti PACT si PKR, lakoko ti agbegbe kẹta (D3) nilo fun imuṣiṣẹ PKR ni fitiro ati ni vivo.Iwadii wa fihan pe DARS-AS1 ni ayanfẹ ṣe ajọṣepọ pẹlu agbegbe D3 (Fig. 3h).Fi fun iwọn nla ti lncRNA (768 nucleotides), asopọ DARS-AS1 si D3 le ṣe idiwọ ibaraenisepo ti ara laarin agbegbe PACT ti dsRBD ati PKR, nitorinaa idilọwọ ẹgbẹ ti PACT ati PKR.Awọn iyipada ojuami PACT ti o rọpo Ser246 ati Ser287 ni D3 pẹlu alanine tabi aspartate ṣe idiwọ isọdọmọ abuda rẹ fun DARS-AS1, n tọka si pataki ti igbekalẹ gbogbogbo ati awọn ohun-ini itanna ni ajọṣepọ wọn.Awọn alaye siwaju si ti ẹrọ yii yoo nilo ni ọjọ iwaju, ni lilo itupalẹ biokemika deede diẹ sii ati itupalẹ igbekalẹ PACT ti o ga.
Awọn ẹkọ iṣaaju ti royin pe DARS-AS1 n ṣe igbelaruge ilọsiwaju sẹẹli nipasẹ awọn ọna ṣiṣe pupọ51,52,53.Ni apẹẹrẹ kan, awọn oniwadi ṣe akiyesi pe DARS-AS1 ṣe atunṣe amuaradagba antisense rẹ ti o fi koodu DARS jiini nipasẹ titojusi miP-194-5p ninu awọn sẹẹli alakan kidinrin.Sibẹsibẹ, ninu iwadi ti o wa lọwọlọwọ, DARS-AS1 knockdown ni ipa diẹ lori iwe-kikọ DARS ni awọn oriṣi ti akàn pupọ, pẹlu o kere awọ, igbaya, ati awọn aarun ẹdọ.Nitori awọn lncRNA ṣe afihan sẹẹli- ati awọn ilana ikosile pato ti ara, awọn ọna ṣiṣe iṣẹ le ma wa ni ipamọ kọja awọn iru alakan, eyiti o le ṣe alabapin si ailẹgbẹ yii laarin awọn akiyesi wa ati awọn igbelewọn iṣaaju ti awọn aarun oriṣiriṣi.Awọn ijinlẹ pataki ni a nilo lati ṣe alaye awọn ọna ṣiṣe kan pato ti ọpọlọpọ awọn ilana ẹkọ nipa ẹkọ nipa ti ẹkọ iṣe-ara ati awọn ilana pathological.
Onínọmbà ti data ile-iwosan fihan pe ikosile DARS-AS1 ninu awọn èèmọ jẹ isọdọtun pẹlu iwalaaye ti awọn alaisan alakan, eyiti o ṣe afihan pataki ti ipo DARS-AS1/PACT/PKR ni asọtẹlẹ akàn.Ni ipari, iwadi wa fihan pe DARS-AS1 jẹ olutọsọna ti ipa-ọna ifihan PACT / PKR, ṣe igbelaruge ilọsiwaju ti awọn sẹẹli alakan, o si ṣe idiwọ apoptosis lakoko idahun iṣoro, eyi ti o pese ila miiran ti iwadi ati pe o jẹ anfani fun iwadi iwaju si awọn itọju ti o pọju. .
Awọn laini sẹẹli eniyan SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ati HEK293T ni a gba lati Amayederun Awọn orisun orisun Laini Cell ti Orilẹ-ede ni Ilu China.Gbogbo awọn sẹẹli ni a tọju ni alabọde DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ni afikun pẹlu 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ati 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ni 37 ° C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));egboogi-eIF2a (phosphorus S51), Abcam (ab32157);egboogi-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);egboogi-β-tubulin, CST (2128);Asin deede IgG, CST (5415S);deede ehoro IgG, CST (2729S).Awọn aporo-ara ni a ti fomi 1:1000 ni PBST fun didi Oorun ati 1:100 fun IP.
Awọn sgRNA ti ni idagbasoke ni lilo ohun elo ti o wa ni gbangba ti a pe ni CRISPR-ERA66.A lo awọn paramita irinṣẹ aiyipada fun idagbasoke sgRNA ati algorithm iṣiro awọn aaye abuda sgRNA ni agbegbe 3 kb.ti dojukọ ni TSS.Awọn adagun omi ti sgRNA oligonucleotides ni a ṣepọ ni CustomArray, Inc.Lapapọ 12 µg ti pgRNA plasmid eniyan ti a dapọ, 7.2 µg ti psPAX2 (Addgene #12260), ati 4.8 µg ti pMD2.G (Addgene #12259) ni a gbe lọ si 5 x 106 HEK293T ni lilo awọn awopọ DNA Transfection 10 cm awọn sẹẹli (CWBIO, Beijing, China) tẹle awọn ilana ti olupese.Awọn alabojuto ọlọjẹ ti o ni kokoro ni a kojọ ni awọn wakati 48 ati 72 lẹhin gbigbe ati ṣe iyọ nipasẹ àlẹmọ 0.45 µm kan.Fun ibojuwo, awọn sẹẹli SW620 ti n ṣalaye amuaradagba idapọ dCas9/KRAB ni a gba nipasẹ gbigbe ọlọjẹ.Awọn sẹẹli SW620 ti a ṣe atunṣe ti ni akoran pẹlu ile-ikawe ọlọjẹ ni awọn adanwo ikolu ominira mẹrin ni MOI ti 0.1-0.3 ati pe a ṣe ayẹwo pẹlu 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) fun awọn ọjọ 2.Lẹhinna, awọn sẹẹli ti gbin fun awọn ọjọ 18 in vitro pẹlu agbegbe ile-ikawe ti o kere ju ti awọn sẹẹli 500/sgRNA fun ibojuwo.
DNA genomic ti jade ni ibamu si awọn ilana ti QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Jẹmánì; 51183).Ni apapọ, 100 μg ti DNA genomic fun atunwi ti ẹda ni a lo lati kọ ile-ikawe naa.Ẹkun sgRNA ti pọsi nipasẹ awọn iyipo meji ti PCR ati sopọ mọ koodu iwọle kan.
Awọn ọja PCR ni a sọ di mimọ nipa lilo NucleoSpin® jeli ati ohun elo isọdọmọ PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Jẹmánì; 740609.250) ati pe o ni iwọn lilo Qubit ™ HS ohun elo wiwa DNA-meji (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ayẹwo MTS ni a lo lati wiwọn ilọsiwaju sẹẹli.Awọn sẹẹli ti wa ni irugbin ninu awọn apẹrẹ 96-daradara ni iwuwo ibẹrẹ ti awọn sẹẹli 2000/kanga.Nọmba ibatan ti awọn sẹẹli ni a wọn lojoojumọ ni akoko itọkasi fun apapọ awọn ọjọ 4-6.Fun kanga kọọkan, 20 μl ti MTS reagent (Promega) ti fomi po pẹlu 100 μl ti DMEM, ti a fi sinu awọn sẹẹli fun awọn wakati 4 ni 37 ° C, lẹhinna OD490 ni iwọn.
Agbara fun idagbasoke ti ko nii ṣe awari nipasẹ ṣiṣe ayẹwo idasile ti awọn aaye.Ni ṣoki, awọn sẹẹli 2000 ti o yipada pẹlu shRNA DARS-AS1 tabi shRNA iṣakoso ni a gbin ni awọn microplates asomọ kekere (Corning) pẹlu iyipada alabọde ni gbogbo ọjọ mẹrin 4.Awọn spheroids ti wa ni kika lẹhin ọjọ 14.Awọn sẹẹli 500 ti o yipada pẹlu plasmid overexpression DARS-AS1 tabi plasmid iṣakoso ni a lo fun imudara imudara, bibẹẹkọ ọna naa ko yipada.
A ṣe atunkọ RNA nipa lilo T7 RNA polymerase ati biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ni ibamu si awọn ilana ti Riboprobe® Awọn ọna Apapo (Promega P1440).Awọn alakoko ti a lo nibi ti wa ni atokọ ni Tabili Iyọnda 4.
Amuaradagba-ifaminsi PACT tabi PKR awọn ẹkun ni ti cloned sinu pET15b (Addgene #73619) ati ki o yipada si BL21(DE3).Awọn kokoro arun naa ni alẹ ni alẹ ni LB ti a pese pẹlu ampicillin ati lẹhinna ti fomi 100-agbo pẹlu LB tuntun.Nigbati OD600 ti alabọde de 0.8, 1 mM IPTG ni a ṣafikun lati fa ikosile amuaradagba.Lẹhin abeabo moju pẹlu gbigbọn onírẹlẹ (250 rpm ni 20°C), a ti gba pellet sẹẹli nipasẹ centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4°C).Daduro pellet sẹẹli ni ifipamọ lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ati incubate lori yinyin fun awọn iṣẹju 30, lẹhinna sonicate (15 min, 5 s tan/pa, lori yinyin) ati centrifuge (13,000) rpm)., 30 min, 4°C).Lẹhin naa a ti gbe elepo naa sori resini Ni-NTA (QIAGEN) ni igba 3 ni 4°C, ti a fo ni igba mẹrin pẹlu ifipamọ fifọ (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ati eluted ni igba 3, pẹlu lapapọ. ti 10 milimita buffer eluent (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).A ṣe ipinnu amuaradagba mimọ ni lilo WB ati pe a pinnu ifọkansi nipa lilo ohun elo idanwo amuaradagba Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Awọn idanwo RIP ni a ṣe bi a ti ṣalaye tẹlẹ, pẹlu awọn iyipada.Ni soki, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x amulumala. (Roche, 1 mM DTT) ati centrifuge ni 13,000 rpm fun awọn iṣẹju 15 ni 4 °C.Supernatant ti wa ni idawọle pẹlu amuaradagba A+G awọn ilẹkẹ oofa (Millipore) ti a so pọ pẹlu 5 μg ti anti-PACT antibody (Abeam) tabi IgG (CST).Awọn ilẹkẹ naa ni a fọ ​​ni igba 5 pẹlu ifipamọ RIP 5x, lẹhinna digested pẹlu proteinase K (NEB).A yọ RNA jade pẹlu Trizol ati ṣiṣe nipasẹ RT-qPCR.Awọn alakọbẹrẹ ni a gbekalẹ ni Ipilẹṣẹ Tabili 5.
Idanwo RIP in vitro ni a ṣe ni ibamu si ilana ilana idanwo RIP boṣewa kan.Apapọ 5 pmol ti in vitro transcribed RNA ti fomi 1x pẹlu ifipamọ RIP ati fifẹ nipasẹ abeabo ni 65°C fun iṣẹju 5 atẹle nipa itutu agbaiye lọra si iwọn otutu yara.Apapọ 5 pmol ti awọn ọlọjẹ PACT ti a fi aami si asia ni a sọ di mimọ lati E. coli.Ṣafikun pẹlu RNA ti a tunṣe fun awọn wakati 2 ni 4°C ki o tẹle ilana ti o wa loke fun itupalẹ RIP fun IP anti-flag.
Fun itupalẹ ifaagun RNA, awọn sẹẹli 1 × 107 ni a lysed pẹlu ifipamọ 1xRIP.Lẹhin centrifugation ni 13,000 rpm fun iṣẹju 15 ni 4°C, supernatant ti wa ni iṣaaju pẹlu 30 μl ti awọn ilẹkẹ oofa streptavidin (Beckman) fun wakati 2 ni 4°C.Lysate ti a sọ di mimọ lẹhinna ti pese pẹlu iwukara tRNA ati pe a fi 40 pmol ti RNA ti a tunṣe pada ni alẹ ni 4°C, lẹhinna fun wakati 2 miiran ati 20 μl ti awọn ilẹkẹ oofa streptavidin tuntun ti dina pẹlu BSA ni a fi kun.Igbesẹ fifọ ni awọn akoko 4 pẹlu ifipamọ RIP 5x ati awọn akoko 4 pẹlu ifipamọ RIP 1x.Awọn ọlọjẹ ti o baamu ni a yọkuro pẹlu ifipamọ elution biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ati pipin lori NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Lẹhin abawọn fadaka (Beyotime Biotechnology), awọn ẹgbẹ kan ti yọkuro ati ṣe atupale nipasẹ MS.
Ayẹwo àjọ-IP ni a ṣe lati ṣe idanwo ibaraenisepo laarin PACT ati PKR.Ni ṣoki, awọn lysates supernatant ni a pese sile nipasẹ sisọ awọn sẹẹli 1 x 107 lysed ni 1 x RIP buffer ti o tẹle pẹlu centrifugation ni 13,000 rpm fun awọn iṣẹju 15 ni 4°C.Lysates ni a kojọpọ pẹlu awọn ilẹkẹ oofa amuaradagba A + G, ti a so pọ pẹlu 5 µg ti anti-PACT antibody, ati rọra yiyi ni alẹ ni 4°C.A fo awọn ilẹkẹ naa ni awọn akoko 3 pẹlu ifipamọ 5 × RIP, lẹẹmeji pẹlu ifipamọ 1 × RIP ati eluted pẹlu ifipamọ 1 × SDS.Awọn amuaradagba ti a gba pada jẹ atupale nipasẹ SDS-PAGE gel ati rii nipasẹ WB.
pmol meji ti PACT ti asia ati 1 pmol ti PKR ni a wẹ lati E. coli.Dilute ni 1× RIP saarin ati incubate pẹlu 10 pmol ti renatured RNA fun wakati 2 ni 4 °C.Lẹhin iyẹn, wọn wa pẹlu amuaradagba A+G magnetic bead-conjugated anti-aami antibody fun afikun wakati meji.Lẹhinna wẹ awọn ilẹkẹ naa ni igba mẹrin pẹlu ifipamọ RIP 1x ati yọkuro pẹlu ifipamọ SDS 1x.Abajade PACT ati PKR ni a rii nipasẹ WB.