Iroyin

O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Awọn ọna isamisi isunmọtosi Enzymatic ti o da lori awọn esters ti a mu ṣiṣẹ tabi awọn ipilẹṣẹ phenoxy jẹ lilo pupọ lati ṣe maapu awọn proteomes subcellular ati awọn ibaraenisepo amuaradagba ninu awọn sẹẹli alãye.Sibẹsibẹ, awọn esters ti a mu ṣiṣẹ ko ni ifaseyin, ti o mu radius isamisi jakejado, ati awọn ipilẹṣẹ phenoxy ti ipilẹṣẹ nipasẹ itọju peroxide le dabaru pẹlu awọn ipa ọna redox.Nibi a ṣe ijabọ ọna isamisi isunmọ ti o gbẹkẹle fọtoactivation (PDPL) ti o dagbasoke nipasẹ jiini sisopọ amuaradagba photosensitizer miniSOG si amuaradagba ti iwulo.Ti nfa nipasẹ ina bulu ati iṣakoso nipasẹ akoko ifihan, awọn atẹgun singlet ti wa ni ipilẹṣẹ ati lẹhinna ni ipinnu spatiotemporally ti o ṣe iyasọtọ awọn iṣẹku histidine nipasẹ iwadii aniline ti waye.A ṣe afihan iṣootọ giga rẹ nipasẹ aworan agbaye-pato proteome.Ifiwewe ẹgbẹ-ẹgbẹ-ẹgbẹ ti PDPL pẹlu TurboID ṣe afihan ni pato diẹ sii ati agbegbe proteomic okeerẹ ti PDPL.Nigbamii ti, a lo PDPL si coactivator transcriptional coactivator ti o ni nkan ṣe pẹlu arun BRD4 ati E3 Parkin ligase ati pe a rii awọn ibaraẹnisọrọ ti a ko mọ tẹlẹ.Nipa ibojuwo overexpression, awọn sobusitireti meji ti a ko mọ, Ssu72 ati SNW1, ni a mọ fun Parkin, eyiti ibajẹ rẹ jẹ ilaja nipasẹ ipa ọna ibi-proteasome.
Isọdi pipe ti awọn nẹtiwọọki amuaradagba ni ipilẹ ọpọlọpọ awọn ilana cellular ipilẹ.Nitorinaa, aworan agbaye ti o peye ga julọ ti awọn ibaraenisepo amuaradagba yoo pese ipilẹ molikula fun ṣiṣafihan awọn ipa ọna ti ibi, ẹkọ nipa arun, ati idalọwọduro awọn ibaraenisepo wọnyi fun awọn idi itọju.Ni ipari yii, awọn ọna ti o lagbara lati ṣawari awọn ibaraenisepo igba diẹ ninu awọn sẹẹli alãye tabi awọn tisọ jẹ iwunilori gaan.Spectrometry Mass Purification Affinity (AP-MS) ti jẹ lilo itan-akọọlẹ lati ṣe idanimọ awọn alabaṣiṣẹpọ abuda ti awọn ọlọjẹ ti iwulo (POI).Pẹlu idagbasoke awọn ọna proteomics pipo, Bioplex3.0 ni a ṣẹda, aaye data ti o tobi julọ ti awọn nẹtiwọọki amuaradagba ti o da lori AP-MS.Botilẹjẹpe AP-MS lagbara pupọ, lysis sẹẹli ati awọn igbesẹ dilution ninu ṣiṣiṣẹsẹhin jẹ alaiṣedeede si alailagbara ati awọn ibaraenisepo abuda igba diẹ ati ṣafihan awọn ohun-ọṣọ-lẹhin-lysis gẹgẹbi awọn orisii ibaraenisepo spurious ti ko ni ipin ṣaaju lysis.
Lati koju awọn ọran wọnyi, awọn amino acids aibikita (UAA) pẹlu awọn ẹgbẹ ọna asopọ ati awọn iru ẹrọ isamisi enzymatic nitosi (PL) (fun apẹẹrẹ APEX ati BioID)5 ti ni idagbasoke.Botilẹjẹpe ọna UAA ti lo ni aṣeyọri ni ọpọlọpọ awọn oju iṣẹlẹ ati pese alaye lori awọn alemora amuaradagba taara, iṣapeye ti aaye ifibọ UAA tun nilo.Ni pataki julọ, o jẹ ọna isamisi stoichiometric ti ko ni ipadasẹhin katalitiki ti awọn iṣẹlẹ isamisi.Ni idakeji, awọn ọna enzymatic PL, gẹgẹbi ọna BioID, dapọ biotin ligase ti a ṣe si POI7, eyiti o mu biotin ṣiṣẹ nigbamii lati ṣe agbedemeji biotinyl-AMP ester ifaseyin.Enzymu naa nitorina ṣe itusilẹ ati tu silẹ “awọsanma” biotin ti a mu ṣiṣẹ ti o ṣe aami awọn iyoku lysine isunmọ.Bibẹẹkọ, BioID nilo diẹ sii ju wakati 12 lọ lati gba ifihan agbara ti o to, eyiti o ṣe idiwọ lilo rẹ pẹlu ipinnu igba diẹ.Lilo itankalẹ itọsọna ti o da lori ifihan iwukara, TurboID jẹ apẹrẹ ti o da lori BioID lati ni imunadoko diẹ sii, gbigba isamisi daradara pẹlu biotin laarin awọn iṣẹju 10, gbigba awọn ilana imudara diẹ sii lati ṣe iwadi.Nitori TurboID n ṣiṣẹ pupọ ati pe awọn ipele biotin endogenous to fun isamisi ipele kekere, isamisi isale di iṣoro ti o pọju nigbati imudara gaan ati isamisi akoko nilo nipasẹ afikun ti biotin exogenous.Ni afikun, awọn esters ti a mu ṣiṣẹ ko ni ifaseyin ti ko dara (t1 / 2 ~ 5 min), eyiti o le ja si radius isamisi nla, paapaa lẹhin itẹlọrun ti awọn ọlọjẹ adugbo pẹlu biotin 5. Ni ọna miiran, idapọ jiini ti ascorbate peroxidase ti a ṣe atunṣe (ie biotin- phenol radicals ati ki o gba aami amuaradagba laarin iṣẹju kan9,10. APEX ti wa ni lilo pupọ lati ṣe idanimọ awọn proteomes subcellular, awọn eka amuaradagba awo, ati awọn amuaradagba amuaradagba ifihan agbara cytosolic11,12. cellular ilana.
Nitorinaa, ọna tuntun ti o lagbara lati ṣe ipilẹṣẹ ifaseyin diẹ sii ti aami ifasilẹ-radius ti ipanilara pẹlu aaye giga ati deede akoko laisi idalọwọduro ni pataki awọn ipa ọna cellular yoo jẹ afikun pataki si awọn ọna ti o wa tẹlẹ. Lara awọn eya ifaseyin, atẹgun ọkan ti o gbe akiyesi wa nitori igbesi aye kukuru rẹ ati radius itọka lopin (t1/2 <0.6 µs ninu awọn sẹẹli)13. Lara awọn eya ifaseyin, atẹgun ọkan ti o gbe akiyesi wa nitori igbesi aye kukuru rẹ ati radius itọka lopin (t1/2 <0.6 µs ninu awọn sẹẹli)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Lara awọn fọọmu ti nṣiṣe lọwọ, atẹgun atẹrin ṣe ifamọra akiyesi wa nitori igbesi aye kukuru rẹ ati radius itọka lopin (t1/2 <0.6 µs ninu awọn sẹẹli)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0.6 µs）命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0.6 1/2 <0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Lara awọn fọọmu ti nṣiṣe lọwọ, atẹgun singlet ṣe ifamọra akiyesi wa nitori igbesi aye kukuru rẹ ati radius itọka lopin (t1/2 <0.6 μs ninu awọn sẹẹli).A ti royin atẹgun Singlet lati ṣe oxidize methionine laileto, tyrosine, histidine ati tryptophan, ṣiṣe ni pola 14,15 fun asomọ si amine tabi thiol orisun probes16,17.Botilẹjẹpe a ti lo atẹgun ẹyọkan lati ṣe aami RNA subcellular yara, awọn ilana fun atunda awọn asami isunmọtosi POI endogenous jẹ aiwadi.Nibi, a ṣe afihan pẹpẹ kan ti a pe ni isamisi isunmọ isunmọ-igbẹkẹle fọto (PDPL), nibiti a ti lo ina bulu lati tan imọlẹ awọn POIs ti o dapọ pẹlu miniSOG photosensitizer kan ati ki o nfa iran atẹgun ti ẹyọkan lati oxidize awọn iṣẹku isunmọ, atẹle nipa awọn iyipada ti o ni amine lati oxidize awọn iwadii kemikali sinu agbedemeji ẹyin..A ṣe idanwo ẹgbẹ kan ti awọn iwadii kẹmika lati mu iyasọtọ tag pọ si ati awọn aaye iyipada ti a damọ nipa lilo iṣan-iṣẹ proteomics ṣiṣi.Ifiwewe ẹgbẹ-ẹgbẹ-ẹgbẹ ti PDPL pẹlu TurboID ṣe afihan ni pato diẹ sii ati agbegbe proteomic okeerẹ ti PDPL.A lo ọna yii si awọn ami-ami-ara-ara ti proteome subcellular ati idanimọ proteome gbogbogbo ti awọn alabaṣiṣẹpọ asopọ fun amuaradagba elepigenetic ti o ni ibatan akàn BRD4 ati E3 ligase Parkin ti o ni ibatan arun Parkinson, eyiti o jẹrisi mejeeji ti a mọ ati nẹtiwọki aimọ ti amuaradagba. awọn ibaraẹnisọrọ..Agbara ti PDPL lati ṣe idanimọ awọn sobusitireti E3 ni awọn eka amuaradagba nla duro fun ipo kan nibiti o nilo idanimọ ti awọn binders aiṣe-taara.Awọn sobusitireti ọgba-itura meji ti a ko mọ ti o laja nipasẹ ubiquitination-proteasome ti jẹrisi ni ipo.
Itọju Photodynamic (PDT) 19 ati chromophore-assisted lesa inactivation (CALI)20, ninu eyiti itanna ina pẹlu awọn fọtosensitizers ṣe ipilẹṣẹ atẹgun ọkan, le mu awọn ọlọjẹ afojusun ṣiṣẹ tabi fa iku sẹẹli.Níwọ̀n bí afẹ́fẹ́ ọ́fẹ́fẹ́ ẹyọ kan ṣoṣo jẹ́ ohun èlò ìmúṣẹ gíga kan pẹ̀lú ijinna ìtújáde ìtúmọ̀ tí ó tó 70 nm, afẹ́fẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹfẹsitizer ni a le ṣakoso.Da lori ero yii, a pinnu lati lo atẹgun singlet lati ṣaṣeyọri isamisi isunmọ ti awọn eka amuaradagba ninu awọn sẹẹli alãye.A ti ṣe agbekalẹ ọna ti chemoproteomic PDPL lati mu awọn iṣẹ mẹrin ṣẹ: (1) lati ṣe itara iran ti atẹgun singlet ti nṣiṣe lọwọ gẹgẹbi ọna enzymatic PL;(2) pese aami-ipinnu akoko lori ibẹrẹ ina;(3) nipasẹ iyipada (4) Yẹra fun lilo awọn alamọdaju ailopin (bii biotin) lati dinku isale, tabi lo awọn reagenous exogenous ti o ga pupọ (bii peroxides) lati dinku ifihan sẹẹli si aapọn ayika.
Photosensitizers le ti wa ni pin si meji isori pẹlu kekere molikula fluorophores iwuwo (fun apẹẹrẹ rose bengal, methylene blue) 22 ati atilẹba ohun kikọ sii awọn ọlọjẹ kekere (fun apẹẹrẹ miniSOG, KillerRed)23.Lati ṣaṣeyọri apẹrẹ modular kan, a ṣe agbekalẹ ipilẹ akọkọ iran PDPL nipa fifi awọn ọlọjẹ photosensitizer (PS) kun si POI24,25 (Figure 1a).Nigba ti a ba tan ina pẹlu ina buluu, oxygen singlet oxidizes isunmọtosi nucleophilic amino acid iṣẹku, Abajade ni ohun umpolung polarity ti o jẹ electrophilic ati ki o le fesi siwaju sii pẹlu amine probe nucleophiles16,17.Iwadi naa jẹ apẹrẹ pẹlu mimu alkyne lati gba kemistri tẹ ki o fa silẹ fun isọdi LC/MS/MS.
Apejuwe sikematiki ti isamisi ti awọn eka amuaradagba ti o laja nipasẹ miniSOG.Nigbati o ba farahan si ina bulu, awọn sẹẹli ti n ṣalaye miniSOG-POI ṣe agbejade atẹgun ẹyọkan, eyiti o ṣe atunṣe awọn ọlọjẹ ibaraenisepo ṣugbọn kii ṣe awọn ọlọjẹ ti ko sopọ.Awọn ọja agbedemeji ti photooxidation jẹ idilọwọ nipasẹ awọn aami isọdọtun ti iwadii kemikali amine lati ṣe awọn idawọle covalent.Ẹgbẹ alkynyl lori iwadii kemistri ngbanilaaye tẹ kemistri fun imudara nipasẹ fifa-isalẹ atẹle nipa iwọn LC-MS/MS.b kemikali be ti amine wadi 1-4.c Aṣoju gel onínọmbà Fuluorisenti ti mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic asami nipa lilo awọn iwadii 1-4 ati iwọn ti ibatan ti o da lori densitometry gel.Iwọn ifihan-si-ẹhin ti awọn iwadii kemikali ni a ṣe ayẹwo ni lilo awọn idanwo iṣakoso odi laisi ina bulu tabi lilo awọn sẹẹli HEK293T laisi ikosile miniSOG.n = 2 biologically ominira awọn ayẹwo.Aami kọọkan duro fun ẹda ẹda kan.d Aṣoju wiwa ati iwọn ti PDP ni lilo iṣapeye 3 ni wiwa tabi isansa ti awọn paati PDPL itọkasi bi c.n = 3 biologically ominira awọn ayẹwo.Aami kọọkan duro fun ẹda ẹda kan.Awọn ila aarin ati awọn whiskers jẹ aṣoju itumọ ati ± iyatọ boṣewa.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Confocal aworan ti awọn singlet atẹgun pẹlu jina-pupa Si-DMA abawọn.Pẹpẹ iwọn: 10 µm.Aworan Gel ati awọn adanwo confocal ni a tun ṣe ni ominira o kere ju lẹmeji pẹlu awọn abajade kanna.
A kọkọ ṣe idanwo agbara awọn miniSOG26 photosensitizers ti o dagba ati KillerRed23, ti a fihan ni iduroṣinṣin ni HEK293T, lati ṣe agbedemeji isamisi propargylamine ti proteome gẹgẹbi iwadii kemikali (Afikun Ọpọtọ. 1a).Atọjade Gel fluorescence fihan pe gbogbo aami proteome ti waye ni lilo miniSOG ati itanna bulu ina, lakoko ti ko si ọja isamisi ti o han pẹlu KillerRed.Lati mu iwọn ifihan-si-ẹhin pọ si, a ṣe idanwo akojọpọ awọn iwadii kemikali ti o ni aniline (1 ati 3), propylamine (2), tabi benzylamine (4) ninu.A ṣe akiyesi pe awọn sẹẹli HEK293T funrara wọn ni ifihan isale ti o ga julọ ni akawe si ko si ina buluu, o ṣee ṣe nitori endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27. Awọn iwadii kẹmika ti o da lori Aniline 1 ati 3 funni ni pato ti o dara julọ, pẹlu HEK293T ni iduroṣinṣin ti n ṣalaye miniSOG ni mitochondria ti n ṣafihan> 8-agbo ilosoke ninu ifihan agbara fun iwadii 3, lakoko ti iwadii 2 ti a lo ni ọna isamisi RNA CAP-seq nikan ni ifihan ~ 2.5- pọsi ifihan agbara agbo, o ṣee ṣe nitori awọn ayanfẹ ifasilẹ oriṣiriṣi laarin RNA ati amuaradagba (Fig. 1b, c). Awọn iwadii kẹmika ti o da lori Aniline 1 ati 3 funni ni pato ti o dara julọ, pẹlu HEK293T ni iduroṣinṣin ti n ṣalaye miniSOG ni mitochondria ti n ṣafihan> 8-agbo ilosoke ninu ifihan agbara fun iwadii 3, lakoko ti iwadii 2 ti a lo ni ọna isamisi RNA CAP-seq nikan ni ifihan ~ 2.5- pọsi ifihan agbara agbo, o ṣee ṣe nitori awọn ayanfẹ ifasilẹ oriṣiriṣi laarin RNA ati amuaradagba (Fig. 1b, c).Awọn iwadii kẹmika ti o da lori Aniline 1 ati 3 ṣe afihan iyasọtọ to dara julọ: HEK293T, eyiti o ṣe afihan miniSOG ni iduroṣinṣin ni mitochondria, ṣafihan diẹ sii ju ilosoke 8-agbo ninu ifihan agbara fun iwadii 3, lakoko ti iwadii 2, ti a lo ni ọna isamisi CAP-seq RNA, nikan fihan ~ 2.5-agbo ifihan agbara ilosoke, jasi nitori orisirisi reactivity lọrun laarin RNA ati amuaradagba (Fig. 1b, c).基于 的 化学 化学 探针 1 和 3 更 更 特异性 特异性 特异性 中 线 表达 表达 信号 信号 信号 信号 信号 信号 于 于 于 于 于 rna 标记 方法 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）.基于 的 化学 化学 探针 1 和 3 更 更 特异性 特异性 特异性 稳定 表达 表达 表达 信号 增加 于 于 于 于 于 于 标记 标记 标记 标记 标记 ~ ~-eq ~ 2 ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAAwọn iwadii kẹmika ti o da lori Aniline 1 ati 3 ni iyasọtọ to dara julọ, HEK293T ṣe afihan miniSOG ni iduroṣinṣin ni mitochondria, ati iwadii 3 ni ilọsiwaju 8-agbo ni ifihan agbara, lakoko ti iwadii 2 fun ọna isamisi CAP-seq RNA fihan nikan ~ 2.5 -agbo ilosoke.ninu awọn ifihan agbara, jasi nitori ti o yatọ lenu ààyò laarin RNA ati amuaradagba (Fig. 1b, c).Ni afikun, awọn isomers probe 3 ati hydrazine probes (probes 5, 6, 7) ni idanwo, ti o jẹrisi iṣapeye ti iwadii 3 (Afikun Afikun. 1b, c).Bakanna, in-gel fluorescence onínọmbà ṣe afihan awọn igbelewọn esiperimenta iṣapeye miiran: gigun igbi irradiation (460 nm), ifọkansi iwadii kẹmika (1 mM), ati akoko irradiation (20 min) (Afikun afikun. 2a-c).Gbigbe eyikeyi paati tabi igbesẹ ninu ilana PDPL yorisi iyipada ifihan agbara pataki si abẹlẹ (Fig. 1d).Ni pataki, aami amuaradagba ti dinku ni pataki ni iwaju sodium azide tabi trolox, eyiti a mọ lati pa atẹgun ọkan.Iwaju D2O, eyiti a mọ lati ṣe iduroṣinṣin atẹgun ẹyọkan, mu ifihan agbara isamisi pọ si.Lati ṣe iwadii ilowosi ti awọn ẹya atẹgun ifaseyin miiran si isamisi, mannitol ati Vitamin C ni a ṣafikun lati fi idi hydroxyl ati superoxide radical scavengers, lẹsẹsẹ, 18, 29, ṣugbọn wọn ko rii lati dinku isamisi.Afikun H2O2, ṣugbọn kii ṣe itanna, ko ja si ni isamisi (Afikun 3a).Aworan atẹgun ti Fluorescence singlet pẹlu awọn iwadii Si-DMA jẹrisi wiwa atẹgun ẹyọkan ninu okun waya HEK293T-miniSOG, ṣugbọn kii ṣe ninu okun waya HEK293T atilẹba.Ni afikun, mitoSOX Red ko le ṣe awari iṣelọpọ superoxide lẹhin itanna (Fig. 1e ati Aworan Apọju. 3b) 30. Awọn data wọnyi ni iyanju ni iyanju pe atẹgun ẹyọkan jẹ ẹya akọkọ ifaseyin atẹgun ti o ni iduro fun isamisi proteomic ti o tẹle.Cytotoxicity ti PDPL ni a ṣe ayẹwo pẹlu itanna bulu ina ati awọn iwadii kemikali, ko si si cytotoxicity pataki ti a ṣe akiyesi (Afikun 4a).
Lati le ṣe iwadi ilana isamisi ati mu idanimọ proteomic ti awọn eka amuaradagba ṣiṣẹ ni lilo LC-MS/MS, a nilo akọkọ lati pinnu iru awọn amino acids ti yipada ati ibi-pupọ delta ti awọn aami iwadii.Methionine, histidine, tryptophan ati tyrosine ni a ti royin pe o jẹ iyipada nipasẹ oxygen singlet14,15.A ṣepọ iṣan-iṣẹ TOP-ABPP31 pẹlu wiwa ṣiṣi aibikita ti a pese nipasẹ ẹrọ iṣiro FragPipe ti o da lori MSFragger32.Lẹhin iyipada atẹgun singlet ati isamisi iwadii kemikali, tẹ kemistri ni a ṣe pẹlu lilo aami idinku biotin ti o ni ọna asopọ cleavable kan, ti o tẹle nina neutravidin ati tito nkan lẹsẹsẹ trypsin.Awọn peptide ti a ti yipada, ti o tun so mọ resini, jẹ fọto ti a ya fun itupalẹ LC-MS/MS (Ọpọlọpọ 2a ati Data Afikun 1).Nọmba nla ti awọn atunṣe waye jakejado proteome pẹlu ju 50 peptide map (PSM) awọn ibaamu ti a ṣe akojọ (Fig. 2b).Iyalenu, a ṣe akiyesi iyipada ti histidine nikan, boya nitori ifaseyin giga ti histidine oxidized si ọna awọn iwadii aniline ju awọn amino acid miiran lọ.Gẹgẹbi ilana ti a tẹjade ti histidine oxidation nipasẹ oxygen singlet, 21,33 ti a pinnu delta-mass structure ti + 229 Da ni ibamu si idawọle ti iwadii 3 pẹlu 2-oxo-histidine lẹhin awọn oxidations meji, lakoko ti +247 Da jẹ ọja hydrolysis ti +229 Da (Afikun olusin. 5).Ayẹwo MS2 julọ.Oniranran fihan igbẹkẹle giga ti idanimọ ti pupọ julọ awọn y ati b ions, pẹlu idanimọ ti awọn ions ajẹkù ti a ti yipada (y ati b) (Fig. 2c).Iṣiro ọrọ-ọrọ ti ilana agbegbe ti awọn histidines ti a ṣe atunṣe ti PDPL ṣe afihan ayanfẹ idiwọn iwọntunwọnsi fun awọn iṣẹku hydrophobic kekere ni awọn ipo ± 1 (Afikun Fig. 4b).Ni apapọ, 1.4 histidines ni a ṣe idanimọ fun amuaradagba, ati awọn aaye ti awọn ami-ami wọnyi jẹ ipinnu nipasẹ agbegbe agbegbe ti o le raye si epo (SASA) ati wiwa iyọdajẹ ibatan (RSA) itupalẹ (Afikun Fig. 4c,d).
Ṣiṣan iṣẹ aiṣedeede fun kikọ ẹkọ yiyan iṣẹku nipa lilo pẹpẹ iširo FragPipe ti o ni agbara nipasẹ MSFragger.Cleavable linkers ti wa ni lilo ni Tẹ kemistri lati gba photocleavage ti títúnṣe peptides lati streptavidin resini.Ti ṣe ifilọlẹ wiwa ṣiṣi lati ṣe idanimọ ọpọlọpọ awọn iyipada, ati awọn iyoku ti o yẹ.b Ṣe ipinnu ọpọlọpọ awọn iyipada ti o waye jakejado proteome.Peptide aworan agbaye PSM.c MS2 spectral annotation of histidine sites títúnṣe pẹ̀lú ìwádìí 3. Gẹ́gẹ́ bí àpẹẹrẹ aṣojú, ìhùwàpadà covalent kan pẹ̀lú ìwádìí 3 fi +229.0938 Da sí amino acid títúnṣe.d Iyipada iyipada ti a lo lati ṣe idanwo fun awọn asami PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) ati PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ni gbigbe pẹlu awọn plasmids iru-igi fun wiwa egboogi-Flag.e Awọn peptide sintetiki ni a ṣe pẹlu miniSOG ti a sọ di mimọ ni iwaju iwadii 3 ati awọn ọja ti o baamu pẹlu Δm +247 ati +229 ni a ṣe akiyesi ni irisi LC-MS.f Awọn ibaraenisepo amuaradagba-si-amuaradagba inu vitro ti a ṣe apẹrẹ pẹlu miniSOG-6xHis-tag ati egboogi-6xAgbogun ara Rẹ.Antibiotin (streptavidin-HRP) ati igbekale egboogi-eku Western blot miniSOG-6xHis/anti-6xAwọn eka egboogi-ara rẹ ti a samisi pẹlu iwadii 3, da lori akoko ifihan si ina.Awọn aami fun awọn ọlọjẹ kọọkan jẹ afihan ni iwuwo molikula ti o baamu: pq ina antibody LC, pq eru antibody HC.Awọn adanwo wọnyi ni a tun ṣe ni ominira o kere ju lẹmeji pẹlu awọn abajade ti o jọra.
Fun ijẹrisi biokemika ti aaye isamisi, PRDX3 ati PRDX1 ti a damọ nipasẹ spectrometry pupọ ni a yipada lati histidine si alanine ati ni afiwe si iru igbẹ ni awọn igbelewọn gbigbe.Awọn abajade PDPL fihan pe iyipada ti o dinku ni pataki ti isamisi (Fig. 2d).Nibayi, awọn ilana peptide ti a mọ ni wiwa ṣiṣi ni a ti ṣajọpọ ati ṣe ni vitro pẹlu miniSOG ti a sọ di mimọ ni iwaju ti iwadii 3 ati ina buluu, awọn ọja ti n pese pẹlu iyipada pupọ ti + 247 ati + 229 Da nigbati a rii nipasẹ LC-MS (Ọpọtọ) .2e).).Lati ṣe idanwo boya ibaraenisepo awọn ọlọjẹ isunmọ le jẹ aami ni vitro ni idahun si miniSOG photoactivation, a ṣe apẹrẹ isunmọ isunmọ atọwọda nipasẹ ibaraenisepo laarin miniSOG-6xHis amuaradagba ati egboogi-egbogi monoclonal Re in vitro (Figure 2f).Ninu idanwo yii, a nireti isamisi isunmọ ti eru antibody ati awọn ẹwọn ina pẹlu miniSOG.Ni otitọ, egboogi-eku (ti o mọ awọn ẹwọn eru ati ina ti egboogi-6xHis-aami) ati streptavidin Western blots ṣe afihan biotinylation ti o lagbara ti awọn ẹwọn eru ati ina.Paapaa, a ṣe akiyesi miniSOG autobiotinylation nitori aami 6xHis ati awọn ọna asopọ agbelebu laarin ina ati awọn ẹwọn eru, eyiti o le ni ibatan si aafo ti a ti ṣalaye tẹlẹ laarin lysine ati idahun isunmọ 2-oxo-histidine.Ni ipari, a pinnu pe PDPL ṣe atunṣe histidine ni ọna ti o gbẹkẹle isunmọ.
Ibi-afẹde wa atẹle ni lati ṣe apejuwe proteome subcellular lati ṣe idanwo ni pato ti isamisi ipo.Nitorinaa, a ṣe afihan miniSOG ni iduroṣinṣin ni arin, matrix mitochondrial, tabi awo ER ode ti awọn sẹẹli HEK293T (Fig. 3a).Ayẹwo Gel fluorescence ṣe afihan awọn ẹgbẹ ti o ni aami lọpọlọpọ ni awọn ipo subcellular mẹta bakannaa awọn ilana isamisi oriṣiriṣi (Fig. 3b).Itupalẹ aworan Fluorescence fihan iyasọtọ giga ti PDPL (Fig. 3c).Awọn iṣẹ ṣiṣe ti PDPL ni atẹle nipasẹ awọn aati titẹ pẹlu awọn awọ rhodamine lati ṣe iyasọtọ awọn proteomes subcellular nipa lilo microscopy fluorescence, ati awọn ifihan agbara PDPL ti wa ni awọpọ pẹlu DAPI, awọn olutọpa mitochondrial, tabi awọn olutọpa ER, ti o jẹrisi ifaramọ giga ti PDPL.Fun awọn ipo organelle mẹta, lafiwe ẹgbẹ-ẹgbẹ-ẹgbẹ ti PDPL pẹlu TurboID nipa lilo avidin western blot fihan pe PDPL jẹ aami diẹ sii ni pataki ni akawe si awọn idari wọn.Labẹ awọn ipo PDPL, awọn ẹgbẹ ti o ni aami diẹ sii han, ti o nfihan diẹ sii awọn ọlọjẹ ti o ni aami-PDPL (Eya afikun. 6a-d).
Aṣoju apẹrẹ ti miniSOG-mediated organelle-patopic proteome labeli.miniSOG fojusi matrix mitochondrial nipasẹ idapọ si N-terminal 23 amino acids ti eniyan COX4 (mito-miniSOG), arin nipasẹ idapọ si H2B (nucleus-miniSOG), ati Sec61β nipasẹ ẹgbẹ cytoplasmic ti awọ ER (ER-miniSOG) ).Awọn itọkasi pẹlu aworan gel, aworan confocal, ati spectrometry pupọ.b Aṣoju jeli awọn aworan ti awọn mẹta organelle-pato PDPL profaili.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Awọn aworan confocal Aṣoju ti awọn sẹẹli HEK293T ti n ṣalaye miniSOG ni iduroṣinṣin pẹlu awọn isọdi subcellular oriṣiriṣi ti a rii nipasẹ antibody ti a samisi V5 (pupa).Awọn asami subcellular jẹ lilo fun mitochondria ati ER (alawọ ewe).Ṣiṣan iṣiṣẹ PDPL pẹlu wiwa ti miniSOG (ofeefee) ti aami awọn proteomes subcellular lilo Cy3-azide tẹ kemistri.Pẹpẹ iwọn: 10 µm.d Awọn igbero folkano ti awọn proteome ti a samisi PDPL ni ọpọlọpọ awọn ẹya ara ti a ṣe iwọn nipasẹ iwọn ti ko ni aami (n = 3 awọn adanwo ti ẹda ti ara ẹni).T-idanwo Akeko oni-meji ni a lo lori awọn igbero onina.Iru egan HEK293T ni a lo bi iṣakoso odi. Awọn ọlọjẹ ti o yipada ni pataki ni afihan ni pupa (p <0.05 ati> 2-agbo ion iyatọ kikankikan). Awọn ọlọjẹ ti o yipada ni pataki ni afihan ni pupa (p <0.05 ati> 2-agbo ion iyatọ kikankikan). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в интенсивности иононо). Awọn ọlọjẹ ti o ṣe pataki ni a ṣe afihan ni pupa (p <0.05 ati> 2-agbo iyatọ ninu kikankikan ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Awọn ọlọjẹ ti o ṣe pataki ni a ṣe afihan ni pupa (p <0.05 ati> iyatọ 2-agbo ni agbara ionic).Awọn ọlọjẹ ti o jọmọ pataki fun HEK293T-miniSOG ṣugbọn kii ṣe pataki fun HEK293T ni a fihan ni alawọ ewe.e Atupalẹ pato ti awọn datasets proteomic lati awọn adanwo d.Nọmba apapọ ti awọn ọlọjẹ pataki ti iṣiro ninu ẹya ara kọọkan (awọn aami pupa ati awọ ewe) ti samisi ni oke.Awọn itan-akọọlẹ fihan awọn ọlọjẹ ti agbegbe ni awọn ẹya ara ti o da lori MitoCarta 3.0, itupalẹ GO ati A. Ting et al.eniyan.Awọn ipilẹ data lọtọ fun mitochondria, awọn arin, ati ER.Awọn adanwo wọnyi ni a tun ṣe ni ominira o kere ju lẹmeji pẹlu awọn abajade ti o jọra.A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.
Ni iyanju nipasẹ gel ati awọn abajade aworan, iyasọtọ ti ko ni aami ni a lo lati ṣe iwọn proteome ti a mọ ni ẹya ara kọọkan (Data Afikun 2).HEK293T ti ko yipada ni a lo bi iṣakoso odi lati yọkuro awọn ami isale. Itupalẹ idite onina ṣe afihan awọn ọlọjẹ imudara pataki (p <0.05 ati> 2-agbo ion kikankikan) bakanna bi awọn ọlọjẹ singleton ti o wa nikan ni awọn laini ifihan miniSOG (Fig. 3d pupa ati awọn aami alawọ ewe). Itupalẹ idite onina ṣe afihan awọn ọlọjẹ imudara pataki (p <0.05 ati> 2-agbo ion kikankikan) bakanna bi awọn ọlọjẹ singleton ti o wa nikan ni awọn laini ifihan miniSOG (Fig. 3d pupa ati awọn aami alawọ ewe). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Itupalẹ idite onina fihan awọn ọlọjẹ imudara pataki (p <0.05 ati> 2-agbo ion kikankikan) bakanna bi awọn ọlọjẹ kan ti o wa ni awọn laini ifihan miniSOG (Fig. 3d, pupa ati awọn aami alawọ ewe).火山图 显示 出 出 显着 显着 富集 富集 <<<<蛋白质 的 强度 强度 强度 强度 强度 在于 在于 在于 在于 的 中 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 (图 3d火山图 显示 出 出 显着 显着 <<<<<<的 强度 强度 强度 强度 强度 在于 在于 在于 在于 在于 的 的 的 蛋白质 蛋白质 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 ...)))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Itupalẹ idite onina ṣe afihan awọn ọlọjẹ imudara pataki (p <0.05 ati> 2x agbara ionic) bakanna bi awọn ọlọjẹ ẹyọkan nikan ti o wa ninu laini ikosile miniSOG (awọn aami pupa ati awọ ewe ni 3d).Apapọ awọn data wọnyi, a ṣe idanimọ 1364, 461, ati 911 iparun pataki iṣiro, mitochondrial, ati awọn ọlọjẹ awo awọ ita ER, lẹsẹsẹ.Lati ṣe itupalẹ deede ti organelle-localized PDPL, a lo MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) onínọmbà, ati A. Ting et al.a ti lo data set8 fun mitochondria, nucleus, ati ER lati ṣe idanwo iyasọtọ organelle ti awọn ọlọjẹ ti a rii, ti o baamu deede ti 73.4, 78.5, ati 73.0% (Fig. 3e).Ni pato ti PDPL jẹrisi pe PDPL jẹ ohun elo to dara julọ fun idamo awọn ọlọjẹ ara-pato.Ni pataki, itupalẹ submitochondrial ti awọn ọlọjẹ mitochondrial ti a damọ fihan pe proteome idẹkùn ni a pin kaakiri ninu matrix ati awo inu inu (226 ati 106, lẹsẹsẹ), ṣiṣe iṣiro fun 91.7% (362) ti apapọ nọmba ti awọn ọlọjẹ mitochondrial ti a damọ.ipele ti o ga ti PDPL ni afikun ti a fi idi mulẹ (Eya afikun. 7a).Bakanna, itupale subnuuclear fihan pe proteome ti o gba ni a pin ni pataki ni arin, nucleoplasm, ati nucleolus (Fig. 7b).Ayẹwo proteomic iparun pẹlu peptide ifihan isọdi agbegbe iparun kan (3xNLS) ṣe afihan deede ti o jọra si itumọ H2B (Eya afikun. 7c–h).Lati pinnu pato ti ami ami PDP, iparun laminin A ni a yan bi ẹgẹ POI7 agbegbe diẹ sii lakaye.PDPL ṣe idanimọ 36 awọn ọlọjẹ ti o ni ilọsiwaju ni pataki, eyiti awọn ọlọjẹ 12 (30.0% pẹlu lamin A) jẹ awọn ọlọjẹ ibaraenisepo lamin A daradara ti a ṣe alaye nipasẹ data data okun, pẹlu ipin ti o ga ju ọna BioID (awọn ọlọjẹ 122) 28 ti 28., 22.9 %) 7. Ọna wa ṣe idanimọ awọn ọlọjẹ diẹ, o ṣee ṣe nitori awọn agbegbe isamisi ti o lopin, eyiti o ṣee ṣe nipasẹ atẹgun singlet ti nṣiṣe lọwọ diẹ sii.Atupalẹ GO fihan pe awọn ọlọjẹ ti a mọ ni o wa ni pataki ni nucleoplasm (26), membrane iparun (10), membrane iparun (9), ati awọn pores iparun (5).Lapapọ, awọn ọlọjẹ ti o wa ni agbegbe iparun yii jẹ 80% ti awọn ọlọjẹ ti o ni ilọsiwaju, ti o ṣe afihan ni pato ti PDPL (Afikun Fig. 8a-d).
Lehin ti iṣeto agbara ti PDPL lati ṣe isamisi isunmọtosi ni awọn ẹya ara, a ṣe idanwo boya a le lo PDPL lati ṣe itupalẹ awọn alabaṣiṣẹpọ POI.Ni pataki, a wa lati ṣalaye itupalẹ PDPL ti awọn ọlọjẹ cytosolic, eyiti a ka si awọn ibi-afẹde ti o nira diẹ sii ju awọn ẹlẹgbẹ agbegbe ti awo-ara wọn nitori ẹda ti o ni agbara pupọ.Awọn bromodomain ati extraterminal (BET) amuaradagba BRD4 ti fa ifojusi wa fun ipa pataki rẹ ni orisirisi awọn aisan 35, 36 .Eka ti a ṣẹda nipasẹ BRD4 jẹ olutọpa transcriptional ati ibi-afẹde itọju pataki kan.Nipa ṣiṣatunṣe ikosile ti c-myc ati awọn ifosiwewe transcription Wnt5a, BRD4 ni a ro pe o jẹ ipinnu bọtini ti aisan lukimia myeloid nla (AML), ọpọ myeloma, lymphoma Burkitt, akàn ikun ati awọn arun iredodo37,38.Ni afikun, diẹ ninu awọn ọlọjẹ fojusi BRD4 lati ṣe ilana gbogun ti ati transcription cellular, gẹgẹbi papillomavirus, HIV, ati SARS-CoV-236,39.
Lati ṣe maapu ibaraenisepo BRD4 ni lilo PDPL, a dapọ miniSOG pẹlu isoform N- tabi C-terminal kukuru ti BRD4.Awọn abajade Proteomic ṣe afihan iwọn giga ti agbekọja laarin awọn itumọ meji (Ọpọtọ Afikun. 9a).Proteome iparun ti a mọ pẹlu miniSOG-H2B ni wiwa 77.6% ti awọn ọlọjẹ ti n ṣepọ pẹlu BRD4 (Afikun 9b).Lẹhinna, awọn akoko oriṣiriṣi ti itanna (2, 5, 10, 20 min) ni a lo lati ṣatunṣe radius asami (Fig. 4a ati data afikun 3).A pari pe ni awọn akoko fọto kukuru, PDPL yoo ṣe aami ni akọkọ awọn alabaṣiṣẹpọ isọdọmọ taara, lakoko ti awọn akoko gigun yoo pẹlu awọn ọlọjẹ ti a damọ lakoko awọn akoko imuṣiṣẹ fọto kukuru bii awọn ibi-afẹde aiṣe-taara ni awọn ile isamisi.Ni otitọ, a ri iṣipopada ti o lagbara laarin awọn aaye akoko ti o wa nitosi (84.6% fun 2 ati 5 min; 87.7% fun 5 ati 10 min; 98.7% fun 10 ati 20 min) (Fig. 4b ati Apọju 9c).Ninu gbogbo awọn ẹgbẹ idanwo, a rii kii ṣe aami isamisi ti ara ẹni BRD4 nikan, ṣugbọn ọpọlọpọ awọn ibi-afẹde ti a mọ gẹgẹbi MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ati HMGB1 ti ṣe alaye ni data okun.Agbara ionic ti awọn ibi-afẹde wọnyi jẹ iwọn si akoko ifihan (Fig. 4c ati Apọju Apọju. 9d).Ayẹwo GO ti awọn ọlọjẹ ti a mọ ni ẹgbẹ 2-iṣẹju fihan pe awọn ọlọjẹ ti a mọ ti wa ni agbegbe ni arin ati pe wọn ni ipa ninu atunṣe chromatin ati iṣẹ RNA polymerase.Išẹ molikula ti amuaradagba jẹ idarato ni isunmọ chromatin tabi iṣakojọpọ transcriptional, ni ibamu pẹlu iṣẹ BRD4 (Fig. 4d).Onínọmbà ibaraenisepo amuaradagba ti okun data ṣe afihan ipele akọkọ ti awọn ibaraenisepo aiṣe-taara laarin BRD4 ati HDAC awọn ile-iṣẹ ibaraenisepo idile gẹgẹbi SIN3A, NCOR2, BCOR, ati SAP130 (Fig. 4e ati Apọju Aworan. 9e), ni ibamu pẹlu BRD4 ati HDAC abuda acetylated histones. ..Ni afikun, awọn ibi-afẹde aṣoju ti a mọ nipasẹ LC-MS/MS, pẹlu Sin3A, NSUN2, Fus, ati SFPQ, ni a fi idi rẹ mulẹ nipasẹ Western blotting (Fig. 4f).Laipẹ, isoform kukuru ti BRD4 ni a ti royin lati dagba awọn ekuro pẹlu awọn ohun-ini ipinya omi-omi-omi (LLPS).Awọn ọlọjẹ abuda RNA Fus ati SFPQ ṣe agbedemeji LLPS ti ọpọlọpọ awọn ilana cellular ati pe a ti ṣe idanimọ nibi bi awọn ọlọjẹ abuda BRD4 ti ko gbasilẹ.Ibaraṣepọ laarin BRD4 ati SFPQ jẹ idaniloju nipasẹ awọn idanwo ajẹsara ajẹsara (co-IP) (Nọmba 4g), ni iyanju ẹrọ miiran fun ipinya olomi-alajaja BRD4 ti o yẹ iwadii siwaju.Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe PDPL jẹ pẹpẹ ti o dara julọ fun idamo ibaraenisepo BRD4 ti a mọ bi daradara bi awọn ọlọjẹ abuda aimọ.
Aṣoju Sikematiki ti isamisi isunmọtosi BRD4 miniSOG-mediated, awọn akoko ifihan: 2, 5, 10, ati 20 min.b Ikọja ti awọn ọlọjẹ ti a damọ ni oriṣiriṣi awọn akoko itanna.Imudara amuaradagba ti a damọ ni HEK293T-miniSOG-BRD4 ṣe pataki ni iṣiro ni akawe si iru-ẹgan HEK293T.c Ion kikankikan nigbati o ba ṣe iwọn aṣoju ti ko ni aami ti a mọ ti awọn ọlọjẹ abuda BRD4 lakoko akoko ifihan pato.n = 3 biologically ominira awọn ayẹwo.Data ti wa ni gbekalẹ bi itumo ± boṣewa iyapa.d Gene ontological onínọmbà (GO) ti awọn ọlọjẹ ti a damọ ni ẹgbẹ iṣẹju 2.Awọn ofin GO mẹwa akọkọ ti wa ni akojọ.Nyoju ti wa ni awọ ni ibamu si awọn GO oro ẹka, ati awọn ti nkuta iwọn ni iwon si awọn nọmba ti awọn ọlọjẹ ri ni kọọkan oro.e Okun igbekale ti awọn ọlọjẹ ibaraenisepo pẹlu BRD4.Awọn iyika ofeefee jẹ lẹ pọ taara ati awọn iyika grẹy jẹ ipele akọkọ ti lẹ pọ aiṣe-taara.Awọn ila pupa jẹ aṣoju awọn ibaraẹnisọrọ ti a pinnu idanwo ati awọn laini buluu duro fun awọn ibaraẹnisọrọ ti asọtẹlẹ.f Aṣoju BRD4 awọn ibi-afẹde abuda ti a damọ ni LC-MS/MS jẹ idaniloju nipasẹ didi Oorun.g Awọn idanwo ajẹsara ajẹsara jẹri ibaraenisepo laarin SFPQ ati BRD4.Awọn adanwo wọnyi ni a tun ṣe ni ominira o kere ju lẹmeji pẹlu awọn abajade ti o jọra.A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.
Ni afikun si idamo awọn ibi-afẹde ti o ni ibatan POI ti ko forukọsilẹ, a pinnu pe PDPL yoo dara fun idamo awọn sobusitireti fun awọn enzymu, eyiti yoo nilo ijuwe ti awọn ọlọjẹ abuda aiṣe-taara ni awọn eka nla lati ṣe alaye awọn sobusitireti ti ko forukọsilẹ.Parkin (ti a fi koodu pa nipasẹ PARK2) jẹ ligase E3 kan ati awọn iyipada ninu ọgba-itura ni a mọ lati fa aarun Parkinson ti ọmọde ti ara ẹni (AR-JP)42.Ni afikun, a ti ṣapejuwe ọgba-itura bi pataki fun mitophagy (mitochondrial autophagy) ati yiyọ awọn eya atẹgun ifaseyin.Bibẹẹkọ, botilẹjẹpe ọpọlọpọ awọn sobusitireti ti o duro si ibikan ti jẹ idanimọ, ipa ti parkin ninu arun yii ko ṣiyemọ.Lati ṣe alaye awọn sobusitireti ti a ko mọ, PDPL ni idanwo nipasẹ fifi miniSOG kun si N- tabi C-terminus ti parkin.A ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) lati mu ṣiṣẹ paki nipasẹ ọna PINK1-Parkin.Ti a ṣe afiwe si awọn abajade BRD4 PDPL wa, idapọ N-terminus parkin ṣe afihan ṣeto ti awọn ọlọjẹ ibi-afẹde kan ti o tobi ju, botilẹjẹpe o bo ipin ti o tobi julọ ti C-terminus (177 ninu 210) (Figure 5a,b ati Data Afikun 4).Abajade jẹ ibamu pẹlu awọn ijabọ ti awọn ami-ami N-terminal le mu Parkin44 ṣiṣẹ ni aberrantly.Iyalenu, awọn ọlọjẹ agbekọja 18 nikan ni o wa ninu data wa pẹlu awọn abajade AP-MS ti a tẹjade fun Parkin43, o ṣee ṣe nitori awọn iyatọ laarin awọn laini sẹẹli ati awọn iṣan-iṣẹ proteomics.Ni afikun si awọn ọlọjẹ mẹrin ti a mọ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ati PSMC3) ti a mọ nipasẹ awọn ọna meji (Fig. 5c) 43.Lati fidi awọn esi ti LC-MS/MS siwaju sii, itọju PDPL ati didi Western ti o tẹle ni a lo lati ṣe afiwe awọn abajade ti ayẹwo sẹẹli obi HEK293T ati laini parkin N-terminal iduroṣinṣin.Awọn ibi-afẹde ti a ko mọ tẹlẹ CDK2, DUT, CTBP1, ati PSMC4 ni idanwo pẹlu afọwọṣe ti a mọ, DNAJB1 (Fig. 5d).
Idite onina ti awọn ọlọjẹ ibaraenisepo ogba ni awọn sẹẹli HEK293T pẹlu miniSOG ti a fi han ni iduroṣinṣin si N- tabi C-terminus ti parkin (n = 3 awọn adanwo onimọ-jinlẹ ominira).T-idanwo Akeko oni-meji ni a lo lori awọn igbero onina.HEK293T ni a lo bi iṣakoso odi. Awọn ọlọjẹ ti o yipada ni pataki ni afihan ni pupa (p <0.05 ati> 2-agbo ion iyatọ kikankikan). Awọn ọlọjẹ ti o yipada ni pataki ni afihan ni pupa (p <0.05 ati> 2-agbo ion iyatọ kikankikan). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в интенсивности иононо). Awọn ọlọjẹ ti o ṣe pataki ni a ṣe afihan ni pupa (p <0.05 ati> 2-agbo iyatọ ninu kikankikan ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Awọn ọlọjẹ ti o ṣe pataki ni a ṣe afihan ni pupa (p <0.05 ati> iyatọ 2-agbo ni agbara ionic).Awọn ọlọjẹ ti o jọmọ pataki fun HEK293T-miniSOG ṣugbọn kii ṣe pataki fun HEK293T ni a fihan ni alawọ ewe.b Venn aworan atọka fifi agbekọja awọn ọlọjẹ laarin N-terminal ati C-ebute oko.Awọn afi N-terminal le mu aberrantly ṣiṣẹ parkin ati ja si ni awọn ọlọjẹ ti o ṣe idanimọ diẹ sii.c Venn aworan atọka afihan awọn ọlọjẹ agbekọja laarin PDPL ati AP-MS.Awọn ibaraẹnisọrọ ti a mọ ti wa ni atokọ, pẹlu 4 ti 18 awọn ọlọjẹ agbekọja ati 11 ti awọn ọlọjẹ 159 ni pato ti a damọ ni PDPL.d Awọn ibi-afẹde Aṣoju ti a damọ nipasẹ LC-MS/MS ni idaniloju nipasẹ didi Oorun.e Ssu72 ati SNW1 ni a damọ bi awọn sobusitireti ọgba-itura ti ko forukọsilẹ.Awọn plasmids amuaradagba ti a samisi FLAG wọnyi ni a yipada si HEK293T ati HEK293T-Parkin-miniSOG atẹle nipa itọju CCCP ni awọn aaye akoko pupọ.Ibajẹ naa jẹ alaye diẹ sii ni laini apọju Parkin.f Lilo proteasome inhibitor MG132, o ti fi idi rẹ mulẹ pe ilana ibajẹ ti Ssu72 ati SNW1 ti wa ni ilaja nipasẹ proteasome-ubiquitination.Awọn adanwo wọnyi ni a tun ṣe ni ominira o kere ju lẹmeji pẹlu awọn abajade ti o jọra.A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.
Ni pataki, awọn ọlọjẹ ti a damọ nipasẹ PDPL gbọdọ pẹlu awọn ọlọjẹ ti o ni asopọ paki ati awọn sobusitireti wọn.Lati ṣe awari awọn sobusitireti ọgba-itura ti ko forukọsilẹ, a yan awọn ọlọjẹ meje ti a damọ (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ati SNW1) ati awọn plasmids ti o yipada lati fi awọn jiini wọnyi han si HEK293T deede ati ni iduroṣinṣin ṣe afihan miniSOG-Parkin's HEK2CCCPT atẹle nipasẹ itọju HEK293T.Awọn ipele ti Ssu72 ati awọn ọlọjẹ SNW1 ti dinku ni pataki ni laini miniSOG-Parkin idurosinsin (Fig. 5e).Itoju pẹlu CCCP fun awọn wakati 12 yorisi ibajẹ pataki julọ ti awọn sobusitireti mejeeji.Lati ṣe iwadii boya ibajẹ ti Ssu72 ati SNW1 ti ni ilana nipasẹ proteasome-ubiquitination, a ti ṣafikun inhibitor proteasome MG132 lati ṣe idiwọ iṣẹ ṣiṣe proteasome, ati ni otitọ a rii pe ilana ibajẹ wọn jẹ idinamọ (Fig. 5f).Awọn afikun awọn ibi-afẹde ti kii ṣe sobusitireti ni a fi idi mulẹ bi awọn ibaraenisepo Parkin ti nlo didi Oorun (Afikun Fig. 10), eyiti o ṣe afihan awọn abajade deede pẹlu LC-MS/MS.Ni ipari, iṣọpọ ti iṣan-iṣẹ PDPL pẹlu iṣeduro iṣeduro gbigbe amuaradagba ti o gba idanimọ ti awọn sobusitireti E3 ligase ti ko forukọsilẹ.
A ti ṣe agbekalẹ pẹpẹ isamisi isunmọtosi ti o fun ọ laaye lati ṣe idanimọ ni aaye ati akoko ibaraenisepo POI.Syeed naa da lori amuaradagba photosensitizer miniSOG, eyiti o jẹ nipa 12 kDa, o kere ju idaji iwọn ti APEX2 henensiamu ti ogbo (27 kDa) ati idamẹta iwọn TurboID (35 kDa).Iwọn ti o kere julọ yẹ ki o faagun titobi awọn ohun elo fun kikọ ẹkọ awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba kekere.Iwakiri siwaju si ti awọn afikun fọtosensitizers, boya awọn ọlọjẹ ti a fi aami si tabi awọn ohun elo kekere, ni a nilo lati mu ikore kuatomu ti atẹgun ẹyọkan pọ si ati faagun ifamọ ti ọna yii.Fun ẹya lọwọlọwọ ti miniSOG, ipinnu akoko giga le ṣee ṣe ni lilo itanna bulu lati mu awọn asami isunmọ ṣiṣẹ.Ni afikun, akoko ifihan to gun tu silẹ “awọsanma” ti o tobi ju ti atẹgun ẹyọkan, ti o yọrisi iyipada ti awọn iṣẹku histidine ti o jinna diẹ sii, radius isamisi ti o pọ si, ati agbara lati ṣe itanran-tunse ipinnu aye-aye PDPL.A tun ṣe idanwo awọn iwadii kẹmika meje lati mu ami ifihan-si-ipilẹ pọ si ati ṣawari ẹrọ molikula lẹhin ọna yii.Ṣiṣan iṣẹ TOP-ABPP ni idapo pẹlu wiwa aiṣedeede ṣiṣii jẹri pe awọn iyipada waye nikan ni awọn histidines ati pe ko si microenvironment deede ti a ṣe akiyesi fun alekun awọn iyipada histidine, ayafi fun yiyan iwọntunwọnsi fun awọn histidines ni agbegbe loop.
A tun ti lo PDPL lati ṣe apejuwe awọn proteomes subcellular pẹlu pato proteome ati agbegbe ni o kere ju afiwera si isamisi isunmọtosi miiran ati awọn ọna iwadii kemikali pato ti ara-ara.Awọn ami isunmọ ti tun ti lo ni aṣeyọri lati ṣe afihan oju-aye, lysosomal, ati awọn proteomes ti o ni ibatan si ikọkọ46,47.A gbagbọ pe PDPL yoo wa ni ibamu pẹlu awọn ẹya ara inu sẹẹli wọnyi.Ni afikun, a koju PDPL nipa idamo awọn ibi-afẹde fun isunmọ amuaradagba cytosolic ti o jẹ eka sii ju awọn ọlọjẹ ti o ni asopọ awopọ nitori awọn ohun-ini agbara wọn ati ilowosi ninu awọn ibaraenisọrọ igba diẹ sii.A lo PDPL si awọn ọlọjẹ meji, transcriptional coactivator BRD4 ati ligase E3 Parkin ti o ni ibatan arun.Awọn ọlọjẹ meji wọnyi ni a yan kii ṣe fun awọn iṣẹ ṣiṣe ipilẹ wọn nikan, ṣugbọn tun fun ibaramu ile-iwosan ati agbara itọju ailera.Fun awọn POI meji wọnyi, awọn alabaṣiṣẹpọ abuda olokiki daradara bi awọn ibi-afẹde ti ko forukọsilẹ ni a mọ.Ni pataki, SFPQ amuaradagba ti o ni ibatan apakan apakan jẹ timo nipasẹ àjọ-IP, eyiti o le ṣe afihan ilana tuntun nipasẹ eyiti BRD4 (isoform kukuru) ṣe ilana LLPS.Ni akoko kanna, a gbagbọ pe idanimọ ti awọn sobusitireti Parkin jẹ oju iṣẹlẹ ninu eyiti a nilo idanimọ ti awọn alemora aiṣe-taara.A ṣe idanimọ awọn sobusitireti ọgba-itura meji ti a ko mọ ati jẹrisi ibajẹ wọn ni ipa ọna ibigbogbo-proteasome.Laipe yii, ilana-iṣe-iṣe-iṣe-iṣere ti a ti ni idagbasoke lati ṣawari awọn sobusitireti hydrolase nipa didẹ wọn pẹlu awọn ensaemusi.Botilẹjẹpe eyi jẹ ọna ti o lagbara pupọ, ko dara fun itupalẹ awọn sobusitireti ti o ni ipa ninu dida awọn eka nla ati pe o nilo dida awọn ifunmọ covalent laarin henensiamu ati sobusitireti.A nireti pe PDPL le faagun lati ṣe iwadi awọn eka amuaradagba miiran ati awọn idile henensiamu, gẹgẹbi awọn deubiquitinase ati awọn idile metalloprotease.
Fọọmu miniSOG tuntun, ti a pe ni SOPP3, ti ni idagbasoke pẹlu ilọsiwaju iṣelọpọ atẹgun ẹyọkan.A ṣe afiwe miniSOG pẹlu SOPP3 ati rii iṣẹ isamisi ilọsiwaju, botilẹjẹpe ipin ifihan-si-ariwo ko yipada (Afikun. 11).A pinnu pe iṣapeye ti SOPP3 (fun apẹẹrẹ, nipasẹ itankalẹ itọsọna) yoo yorisi awọn ọlọjẹ fọtosensitizer ti o munadoko diẹ sii ti o nilo awọn akoko ina kukuru ati nitorinaa gba awọn ilana cellular ti o ni agbara diẹ sii lati mu.Ni pataki, ẹya lọwọlọwọ ti PDPL wa ni opin si agbegbe cellular bi o ṣe nilo itanna ina bulu ati pe ko le wọ inu awọn iṣan ti o jinlẹ.Ẹya yii ṣe idiwọ lilo rẹ ni awọn ikẹkọ awoṣe ẹranko.Sibẹsibẹ, apapọ awọn optogenetics pẹlu PDPL le pese aye fun iwadii ẹranko, paapaa ni ọpọlọ.Ni afikun, awọn fọtosensitizers infurarẹẹdi ti a ṣe atunṣe tun yọ aropin yii kuro.Iwadi n lọ lọwọlọwọ ni agbegbe yii.
Laini sẹẹli HEK293T ni a gba lati ATCC (CRL-3216).Laini sẹẹli ṣe idanwo odi fun ikolu mycoplasma ati pe a gbin ni DMEM (Thermo, #C11995500BT) ni afikun pẹlu 10% omi ara inu oyun (FBS, Vistech, #SE100-B) ati 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).dagba ninu.
3-Aminophenylene (ayẹwo 3) ati (4-ethynylphenyl) methanamine (ayẹwo 4) ni a ra lati Bidepharm.Propylamine (iwadii 2) ni a ra lati Awọn kemikali Agbara.N- (2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (iwadii 1) ti ṣajọpọ gẹgẹbi awọn ọna ti a tẹjade.
Àfikún Tabili 1 ṣe àtòjọ àwọn ìtumọ̀ àbùdá tí a lò nínú ìwádìí yìí.Awọn ilana miniSOG ati KillerRed ti wa ni cloned lati ẹbun plasmid lati P. Zou (Ile-ẹkọ giga Peking).Ilana ibi-afẹde mitochondrial mitochondrial jẹ yo lati 23 N-terminal amino acids ti COX4 ati ki o cloned sinu awọn ifọkasi itọkasi nipa lilo apejọ Gibson (Beyotime, #D7010S).Lati ṣe ifọkansi awọ-ara ati arin ti reticulum endoplasmic, SEC61B DNA eniyan (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ti o pọju nipasẹ PCR lati inu iwe-ikawe cDNA ti awọn sẹẹli HEK293T, ati H2B DNA (ti a fi funni nipasẹ D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ati cloned, bi a ti sọ loke.Ayafi ti itọkasi bibẹẹkọ, awọn jiini amuaradagba miiran ti a lo fun gbigbe ati ikole awọn laini sẹẹli iduroṣinṣin ni a pọ si PCR lati ile-ikawe cDNA sẹẹli HEK293T.G3S (GGGS) ati G4S (GGGGS) ni a lo bi awọn asopọ laarin amuaradagba bait ati miniSOG.Aami apọju V5 kan (GKPIPNPLLGLDST) ni a ṣafikun si awọn itumọ idapọ wọnyi.Fun ikosile ninu awọn ẹran-ọsin ati lati fi idi laini sẹẹli iduroṣinṣin kan mulẹ, itumọ idapọ miniSOG jẹ subcloned sinu pLX304 vector lentiviral.Fun ikosile kokoro-arun, miniSOG ti di oniye sinu pET21a fekito ti a samisi 6xHis ni C-terminus.
Awọn sẹẹli HEK293T ti wa ni irugbin ni awọn sẹẹli 2.0 x 105 fun daradara ni awọn awo-daradara mẹfa ati gbigbe awọn wakati 24 lẹhinna pẹlu awọn plasmids lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) ati awọn plasmids apoti gbogun ti (1.5 μg psPAX2 ati 1.2 μG) pMD pẹlu lilo Lipo. , #C0533), nipa 80% idapọ.Lẹhin gbigbe ni alẹ moju, alabọde naa ti yipada ati ki o fi sii fun wakati 24 miiran.Ikojọpọ ọlọjẹ naa ni a ṣe lẹhin awọn wakati 24, 48 ati 72.Ṣaaju ki o to ikolu ti awọn laini sẹẹli afojusun, alabọde gbogun ti wa ni filtered nipasẹ 0.8 μm àlẹmọ (Merck, #millex-GP) ati polybrene (Solarbio, #H8761) ni a fi kun si ifọkansi ti 8 μg/ml.Lẹhin awọn wakati 24, a gba awọn sẹẹli laaye lati gba pada nipa yiyipada alabọde naa.Awọn sẹẹli ti yan nipa lilo 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) fun awọn ọna mẹta akọkọ bi yiyan okun kekere.Lẹhinna lo 20 μg / milimita bi ilana ti o ni okun diẹ sii fun awọn ọna mẹta to nbọ.
Awọn sẹẹli ti wa ni irugbin ni awọn iyẹwu 12-kanga (Ibidi, #81201) ni iwuwo ti o to awọn sẹẹli 20,000 fun kanga kan.Lati ṣe ilọsiwaju ifaramọ ti awọn sẹẹli HEK293T, ṣafikun 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) ti fomi po ni saline buffered fosifeti (PBS, Sangon, #B640435) ni 37°C.Awọn iyẹwu ti wa ni iṣaaju fun wakati 1 ati lẹhinna yọ kuro pẹlu PBS.Lẹhin awọn wakati 24, awọn sẹẹli ti fọ ni ẹẹkan pẹlu PBS, ti a fi sii pẹlu 1 mM probe 3 ni ojutu iyọ iwontunwonsi Hanks tuntun (HBSS, Gibco, #14025092) fun wakati 1 ni 37°C, ati lẹhinna ṣe afikun pẹlu LED bulu (460 nm) ).) ti wa ni itanna fun awọn iṣẹju 10 ni iwọn otutu yara.Lẹhin iyẹn, awọn sẹẹli ti wẹ lẹẹmeji pẹlu PBS ati ti o wa titi pẹlu 4% formaldehyde ni PBS (Sangon, #E672002) fun awọn iṣẹju 15 ni iwọn otutu yara.A yọkuro formaldehyde ti o pọju lati awọn sẹẹli ti o wa titi nipasẹ fifọ ni igba mẹta pẹlu PBS.Awọn sẹẹli lẹhinna wa ni ayeraye pẹlu 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ni PBS ati fo ni igba mẹta pẹlu PBS.Lẹhinna yọ iyẹwu naa kuro ki o ṣafikun si ayẹwo kọọkan 25 µl ti idapọ ifaseyin titẹ ti o ni 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ati 0.5 mg / ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) ati ki o ṣabọ fun awọn iṣẹju 30 ni iwọn otutu yara.Lẹhin iṣesi imolara, awọn sẹẹli ti fọ ni igba mẹfa pẹlu PBS ti o ni 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ati lẹhinna dina pẹlu 5% BSA (Abcone, #B24726) ni PBST fun ọgbọn išẹju 30 ni iwọn otutu yara.
Fun ajẹsara ajẹsara colocalization, awọn sẹẹli ti wa ni idapo pẹlu awọn ọlọjẹ akọkọ ni ibamu si awọn ipo itọkasi: Asin anti-V5 tag mAb (1: 500, CST, #80076), ehoro anti-Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, #A0564), ehoro polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) tabi ehoro egboogi-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) ni 4 °C moju.Lẹhin ti fifọ awọn akoko 3 pẹlu PBST, awọn sẹẹli ti wa ni idapo pẹlu awọn egboogi-egbogi keji: ewurẹ egboogi-ehoro Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) ti fomi 1:1000, ewurẹ anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) ti fomi 1:1000.dilution Dilute ni yara otutu fun 30 iṣẹju.Lẹhinna a fọ ​​awọn sẹẹli ni igba 3 pẹlu PBST ati pe a dapọ pẹlu DAPI (Thermo, #D1306) ni PBS fun awọn iṣẹju 10 ni iwọn otutu yara.Lẹhin awọn fifọ 3 pẹlu PBS, awọn sẹẹli ti wa ni edidi ni 50% glycerol (Sangon, #A600232) ni PBS fun aworan.Awọn aworan ajẹsara ti a gba ni lilo ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope ati sọfitiwia ZNE 3.5.
Fun aworan fluorescent atẹgun ti ẹyọkan, awọn sẹẹli ti fọ lẹẹmeji pẹlu ifipamọ Hanks HEPES ṣaaju fifi 100 nM Si-DMA kun ni ifipamọ Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Lẹhin ifihan si ina, awọn sẹẹli ti wa ni idawọle ninu incubator CO2 ni 37 ° C fun awọn iṣẹju 45.Lẹhinna a fọ ​​awọn sẹẹli lẹẹmeji pẹlu ifipamọ Hanks 'HEPES ati pe o ni idamu pẹlu Hoechst ni ifipamọ Hanks' HEPES fun awọn iṣẹju 10 ni iwọn otutu yara ati wiwo ni lilo microscope confocal ZEISS LSM 900., #M36008) ninu ifipamọ HBSS ti o ni kalisiomu ati iṣuu magnẹsia ninu.Lẹhin ifihan si ina tabi doxorubicin (MCE, #HY-15142A), awọn sẹẹli ti wa ni idawọle ninu incubator CO2 ni 37 ° C. fun awọn iṣẹju 10, ti a wẹ lẹẹmeji pẹlu ifipamọ HBSS, ati pe pẹlu Hoechst ni ifipamọ HBSS ni iwọn otutu yara.iseju.Doxorubicin ni a lo bi iṣakoso iwadii rere nibiti a ti ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu 20 μM doxorubicin ninu HBSS ti o ni 1% BSA fun 30 min.Awọn aworan imunofluorescent ni a gba nipa lilo maikirosikopu confocal Zeiss LSM 900 kan.
Awọn sẹẹli HEK293T ti n ṣalaye mito-miniSOG ni imurasilẹ ni a ti gbin ni iwuwo ti isunmọ 30% ni awọn ounjẹ 15 cm.Lẹhin awọn wakati 48, nigbati ~ 80% confluence ti de, awọn sẹẹli naa ni a fọ ​​ni ẹẹkan pẹlu PBS, ti a fi sii pẹlu 1 mM Probe 3 ni ifipamọ HBSS tuntun fun wakati 1 ni 37°C ati lẹhinna tan imọlẹ pẹlu LED buluu fun iṣẹju mẹwa 10 ni yara. otutu..Lẹhinna, a ti fọ awọn sẹẹli naa lẹẹmeji pẹlu PBS, ti fọ ati tun da duro ni yinyin PBS buffer yinyin ti o ni awọn inhibitors protease ti ko ni EDTA (MCE, #HY-K0011).Awọn sẹẹli ti a lysed nipasẹ sonicating awọn sample fun 1 iseju (1 iṣẹju lori ati 1 aaya pa ni 35% titobi).Abajade ti o wa ni centrifuged ni 15,871 xg fun awọn iṣẹju 10 ni 4 ° C lati yọ idoti kuro, ati pe a ṣe atunṣe ifọkansi ti o pọju si 4 mg/mL nipa lilo ohun elo amuaradagba BCA (Beyotime, #P0009).Darapọ 1 milimita ti lysate ti o wa loke pẹlu 0.1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), ati 1 mMMtor CucumberSO4 yiyi soke fun wakati 1 ni iwọn otutu yara.Lẹhin iṣesi imolara, ṣafikun adalu si ojutu ti a dapọ tẹlẹ (MeOH: CHCl3: H2O = 4 milimita: 1 ml: 3 milimita) ni gilasi gilasi 10 milimita.Awọn ayẹwo ni a dapọ ati centrifuged ni 4500 g fun awọn iṣẹju 10 ni iwọn otutu yara.Awọn ojutu ti isalẹ ati oke ni a sọnù, a ti fọ ihalẹ naa lẹẹmeji pẹlu 1 milimita ti methanol ati centrifuged ni 15871 × g fun 5 min ni 4 ° C.Fi 1 milimita ti 8 M urea (Aladdin, no. U111902) ni 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) lati tu awọn precipitate.Awọn ayẹwo ni a tun ṣe pẹlu 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 ni 25 mM ABC) fun awọn iṣẹju 40 ni 55 ° C ti o tẹle pẹlu afikun 15 mM iodoacetamide tuntun (Sangon, # A600539) ni iwọn otutu yara ni okunkun.Alkylation laarin 30 iṣẹju..Afikun 5 mM dithiothreitol ni a ṣafikun lati da iṣesi duro.Mura ni isunmọ 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) fun ayẹwo kọọkan nipa fifọ ni igba mẹta pẹlu 1 milimita PBS.Ojutu proteome ti o wa loke ti fomi po pẹlu 5 milimita PBS ati pe o ni idapo pẹlu awọn ilẹkẹ agarose NeutrAvidin ti a ti fọ tẹlẹ fun awọn wakati 4 ni iwọn otutu yara.Lẹhinna wẹ awọn ilẹkẹ naa ni igba mẹta pẹlu 5 milimita PBS ti o ni 0.2% SDS (Sangon, #A600485), awọn akoko 3 pẹlu 5 milimita PBS ti o ni urea 1M, ati awọn akoko 3 pẹlu 5 milimita ddH2O.Awọn ilẹkẹ lẹhinna ni ikore nipasẹ centrifugation ati tun pada ni 200 μl ti 25 mM ABC ti o ni 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) ati 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize moju ni 37°C pẹlu yiyi.Idahun naa duro nipa fifi formic acid kun (Thermo, # A117-50) titi pH fi de 2-3.Awọn ilẹkẹ ti wẹ ni igba mẹta pẹlu 1 milimita ti PBS ti o ni 0.2% SDS, awọn akoko 3 pẹlu 1 milimita ti PBS ti o ni urea 1 M, ati lẹhinna awọn akoko 3 pẹlu 1 milimita ti omi distilled.Awọn peptides ti a ti yipada ni idasilẹ nipasẹ ina lysis (365 nm) fun awọn iṣẹju 90 ni lilo 200 μl ti 70% MeOH.Lẹhin ti centrifugation, awọn supernatant ti a gba.Lẹhinna a fọ ​​awọn ilẹkẹ naa ni ẹẹkan pẹlu 100 μl ti 70% MeOH ati awọn alamọdaju ti wa ni idapọ.A ti gbẹ awọn ayẹwo ni iyara igbale igbale Speedvac ati fipamọ ni -20°C titi ti itupalẹ.
Lati ṣe idanimọ ati ṣe iwọn awọn peptides atẹgun ti a ṣe atunṣe, awọn ayẹwo ni a tuntu ni 0.1% formic acid ati 1 μg ti peptides ni a ṣe atupale nipa lilo Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer ti o ni ipese pẹlu orisun ESI nano lati Tune ati Xcalibur lati ọdọ sọfitiwia ataja 4.3.Awọn ayẹwo ni a yapa lori 75 µm × 15 cm ti o wa ninu iwe capillary ti o wa ni inu pẹlu ohun elo 3µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) ati pe o ni asopọ si EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Awọn peptides ni a yapa nipasẹ laini 95 gradient chromatography lati 8% epo B si 50% epo B (A = 0.1% formic acid ninu omi, B = 0.1% formic acid ni 80% acetonitrile), lẹhinna laini pọ si 98% B min ni 6 min ni iwọn sisan ti 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos gba data ni omiiran laarin ọlọjẹ MS ni kikun ati ọlọjẹ MS2 da lori data naa.Awọn foliteji sputtering ti ṣeto si 2.1 kV ati awọn iwọn otutu ti ion irinna capillary je 320°C.MS spectra (350-2000 m/z) ni a gba pẹlu ipinnu ti 120,000, AGC 4 × 105, ati akoko titẹ sii ti o pọju ti 150 ms.10 ti o wọpọ julọ ni isodipupo agbara idiyele ni kikun ọlọjẹ kọọkan jẹ pipin ni lilo HCD pẹlu agbara ikọlu deede ti 30%, window ipinya quadrupole ti 1.6 m/z, ati eto ipinnu ti 30,000.Ibi-afẹde AGC kan fun iwoye ọpọ eniyan tandem ni lilo 5 × 104 ati akoko titẹ sii ti o pọju 150 ms.Iyatọ ti o ni agbara ti ṣeto si awọn aaya 30. Awọn ions ti a ko pin tabi awọn ti o ni idiyele 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS. Awọn ions ti a ko pin tabi awọn ti o ni idiyele 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Awọn ions ti a ko pin tabi awọn ions pẹlu idiyele 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Awọn ions ti a ko ni pato tabi awọn ions pẹlu awọn idiyele ti 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS.
Awọn data aise ti ni ilọsiwaju nipa lilo Syeed iširo FragPipe ti o da lori MSFragger.Awọn aibikita pupọ ati awọn amino acids ti o baamu ni a pinnu nipa lilo algorithm wiwa ṣiṣi pẹlu ifarada ibi-iṣaaju ti -150 si 500 Da.Awọn peptides ti a ti yipada lẹhinna ni idanimọ nipa lilo awọn iyipada histidine pẹlu awọn anfani pupọ ti + 229.0964 ati + 247.1069 Da ni PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Awọn sẹẹli ti n ṣalaye ni imurasilẹ jiini miniSOG ti a dapọ ni a palara ni awọn ounjẹ 6 cm.Nigbati o ba de ~80% confluence, awọn sẹẹli ti fo ni ẹẹkan pẹlu HBSS (Gibco, #14025092), lẹhinna ti a dapọ pẹlu awọn iwadii kemikali ni HBSS fun wakati kan ni 37°C ati tan imọlẹ pẹlu ina bulu.10W LED fun awọn iṣẹju 20 ni iwọn otutu yara.Lati mọ iru iru awọn ẹya atẹgun ifaseyin ti o ni ipa ninu PDPL, 0.5 mM Vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Kemikali Agbara, # 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ni a fi kun si awọn sẹẹli bi awọn afikun.Lẹhin fifọ pẹlu PBS tutu, a ti fọ awọn sẹẹli, ti a gba ni awọn tubes centrifuge 1.5 milimita, ati sonicated pẹlu sample fun 1 min ni 200 μl ti PBS pẹlu 1x protease inhibitor laisi EDTA (1 s ati 1 s laisi, titobi 35%).Adalu ti o yọrisi jẹ centrifuged ni 15,871 × g fun awọn iṣẹju 10 ni 4 °C ati pe a ṣatunṣe ifọkansi agbara si 1 mg/mL nipa lilo ohun elo amuaradagba BCA kan.Ni isunmọ 50 µl ti lysate ti o wa loke ti wa ni idapọ pẹlu 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ati 1 mM CuSO4 fun wakati 1 ni iwọn otutu yara pẹlu yiyi lati isalẹ si oke.Lẹhin ifasilẹ ti tẹ, ojoriro pẹlu acetone ni a ṣe nipasẹ fifi 250 μl ti acetone ti a ti tutu-si tẹlẹ si awọn ayẹwo, incubating ni -20 ° C fun awọn iṣẹju 20 ati centrifuging ni 6010 × g fun 10 min ni 4 ° C.Gba pellet ati sise ni 50 µl ti 1x Laemmli's ifipamọ fun iṣẹju 10 ni 95 °C.Awọn ayẹwo lẹhinna ṣe atupale lori awọn gels gigun SDS-PAGE ati wiwo ni lilo Bio-rad ChemiDoc MP Touch aworan eto pẹlu sọfitiwia Aworan Lab Touch.
Isọjade ati isọdọtun ti miniSOG-6xAmuaradagba recombinant ni a ṣe gẹgẹ bi a ti ṣalaye tẹlẹ.Ni ṣoki, awọn sẹẹli E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) ti yipada pẹlu pET21a-miniSOG-6xHis ati ikosile amuaradagba pẹlu 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Lẹhin ti cell lysis, awọn ọlọjẹ ti wa ni mimọ nipa lilo Ni-NTA agarose beads (MCE, no. 70666), ti a ṣe ayẹwo ni ilodi si PBS, ati ti o fipamọ ni -80°C.
Fun idanwo isunmọtosi aami-ara-ara-ara in vitro aami, dapọ 100 μM mimọ miniSOG, 1 mM probe 3, ati 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) ni PBS si iwọn ifapa lapapọ ti 50 μl..Adalu ifaseyin naa jẹ itanna pẹlu ina LED bulu fun 0, 2, 5, 10, ati 20 min ni iwọn otutu yara.A ti fi adalu naa pọ pẹlu 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, # B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ati 1 mM CuSO4 fun 1 h ni iwọn otutu yara lori gbigbọn išipopada si oke.Lẹhin iṣesi imolara, ṣafikun ifipamọ Laemmli 4x taara si adalu ati sise ni 95°C fun iṣẹju 10.Awọn ayẹwo ni a ṣe atupale lori awọn gels SDS-PAGE ati atupale nipasẹ iwo-oorun pẹlu streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
peptide sintetiki ti o ni histidine pẹlu amidation C-terminal (LHDALDAK-CONH2) ni a lo lati ṣe itupalẹ peptide ti o wa nitosi isamisi in vitro.Ninu idanwo yii, 100 μM ti a sọ di mimọ miniSOG, 10 mM probe 3 ati 2 μg / ml peptide sintetiki ni a dapọ ni PBS ni iwọn ifapa lapapọ ti 50 μl.Adalu ifaseyin ti ni itanna pẹlu ina LED bulu fun wakati 1 ni iwọn otutu yara.Ayẹwo microliter kan ni a ṣe atupale nipa lilo eto LC-MS (Omi, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer pẹlu MassLynx spectrum onínọmbà software).
Awọn sẹẹli HEK293T ni iduroṣinṣin ti n ṣalaye jiini idapọ miniSOG ni a ti gbin ni awọn ounjẹ cm 10 fun awọn laini pẹlu isọdi agbegbe ti ara (Mito, ER, Nucleus) ati awọn ounjẹ 15 cm fun Parkin-miniSOG ati awọn laini BRD4-miniSOG.Nigbati o ba de ~90% confluence, awọn sẹẹli naa ni a fọ ​​ni ẹẹkan pẹlu HBSS, lẹhinna fiwewe pẹlu iwadii 3 ni HBSS fun wakati 1 ni 37°C ati tan imọlẹ pẹlu LED bulu 10 W ni iwọn otutu yara.Fun isamisi ti kii ṣe olubasọrọ ti Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) pẹlu iwadii 3 ni HBSS ni a ṣafikun fun wakati kan ni 37°C.Awọn sẹẹli lysis, tẹ kemistri, idinku ati awọn igbesẹ alkylation jẹ kanna gẹgẹbi a ti salaye loke, ayafi ti 2 miligiramu ti lysate ti fi kun ati pe a lo biotin PEG3 azide ni titẹ titẹ dipo biotin azide photodegradable.Lẹhin imudara, awọn ilẹkẹ ti wẹ ni igba mẹta pẹlu 5 milimita ti PBS ti o ni 0.2% SDS, awọn akoko 3 pẹlu 5 milimita ti PBS ti o ni urea 1 M, ati awọn akoko 3 pẹlu 5 milimita ti PBS.Lẹhinna, 2 µg trypsin ni a ṣafikun si 300 µl 25 mM ABC ti o ni urea 1 M lati ya amuaradagba ni alẹ ni 37°C.Idahun naa duro nipa fifi formic acid kun titi pH ti 2-3 ti de.Lẹhin ti trypsinization lori awọn ilẹkẹ, ojutu peptide jẹ desalted ni lilo ọwọn SOLAµ HRP kan (Thermo, #60209-001) ti a si gbẹ ninu ifọkansi igbale Speedvac kan.A tuntu peptides ni 0.1% formic acid ati 500 ng ti peptides ni a ṣe atupale nipa lilo Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer ti o ni ipese pẹlu orisun nano-ESI ti a ṣalaye loke.A ya awọn Peptides lori awọn ami-ami RP-HPLC ti iṣowo (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) ati awọn ọwọn RP-HPLC analytical (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), mejeeji kun pẹlu 2 μm.gradient lati 8% si 35% ACN ni awọn iṣẹju 60, lẹhinna laini pọ si 98% B ni awọn iṣẹju 6 ni iwọn sisan ti 300 Nl/min.MS spectra (350-1500 m/z) ni a gba pẹlu ipinnu ti 60,000, AGC 4 × 105, ati akoko titẹ sii ti o pọju ti 50 ms.Awọn ions ti a ti yan ni a pin lẹsẹsẹ nipasẹ HCD ni awọn akoko 3 s pẹlu agbara ikọlu deede ti 30%, window ipinya quadrupole kan ti 1.6 m/z, ati ipinnu ti 15000. A 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC afojusun ati akoko abẹrẹ ti o pọju ti 22 ms won lo.Iyasọtọ ti o ni agbara ti ṣeto si awọn aaya 45. Awọn ions ti a ko pin tabi awọn ti o ni idiyele 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS. Awọn ions ti a ko pin tabi awọn ti o ni idiyele 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Awọn ions ti a ko pin tabi awọn ions pẹlu idiyele 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Awọn ions ti a ko ni pato tabi awọn ions pẹlu awọn idiyele ti 1+ ati>7+ ni a kọ fun MS/MS.
Awọn igbesẹ igbaradi ayẹwo soke si imudara ti awọn ilẹkẹ NeutrAvidin jẹ kanna gẹgẹbi ninu itupalẹ LC-MS/MS ti a ṣalaye loke.O fẹrẹ to 50 μg ti lysate ni a lo bi titẹ sii fun iṣakoso ikojọpọ ati 2 miligiramu ti lysate ni a lo fun awọn aati tẹ.Lẹhin imudara ati fifọ pẹlu neutravidin, awọn ọlọjẹ ti a dè ni a yọ kuro nipa fifi 50 μl ti ifipamọ Laemmli kun si awọn ilẹkẹ resini agarose ati sise ni 95 ° C. fun awọn iṣẹju 5.Iṣagbewọle fifuye iṣakoso ati awọn ayẹwo imudara ilẹkẹ ni a ṣe atupale nipasẹ SDS-PAGE ati gbe lọ si awọn membran PVDF (Millipore, #ISEQ00010) nipasẹ awọn ọna iwo-oorun abawọn boṣewa.Awọn membran naa ti dina pẹlu 5% wara skim (Sangon, #A600669) ninu TBS ti o ni 0.1% tween-20 (TBST) ninu ati ti a fi sii ni atẹlera pẹlu awọn egboogi akọkọ ati atẹle.Awọn aporo-ara akọkọ jẹ ti fomi 1:1000 ni 5% wara ti o yọ ninu TBST ati pe a fi sii ni alẹ moju ni 4°C.A lo awọn aporo-ara elekeji ni ipin kan ti 1:5000 ati pe a fi sii fun wakati kan ni iwọn otutu yara.Awọn membran ti wa ni wiwo nipasẹ chemiluminescence nipa lilo eto aworan Chemidoc MP.Gbogbo awọn iwoye ti a ko ge ti awọn abawọn ati awọn gels ninu eeya naa ni a gbekalẹ bi data aise.
Awọn egboogi akọkọ ti a lo ninu iwadi yii pẹlu ehoro anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), ehoro anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), egboogi-mSin3A polyclonal antibody ehoro (Abcam, #ab3479), ehoro egboogi-tag monoclonal antibody (TransGen, #HT201-02), Asin anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), egboogi ehoro -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), ehoro monoclonal antibody to CTBP1 (ABclonal, #A11600), ehoro polyclonal antibody to DUT (ABclonal, #A2901), ehoro polyclonal antibody to PSMC4 (ABclonal, #A2505), ehoro egboogi-ehoro. DNAJB1 polyclonal antibody (ABclonal, # A5504).Awọn egboogi wọnyi ni a lo ni 1:1000 dilution ni 5% wara skim ni TBST.Awọn aporo-ara Atẹle ti a lo ninu iwadi yii pẹlu egboogi-ehoro IgG (TransGen, #HS101-01), egboogi-eku IgG (TransGen, #HS201-01) ni 1:5000 dilution.
Lati ṣe iwadii siwaju boya BRD4 ṣe ibaraenisepo pẹlu SFPQ, HEK293T iduroṣinṣin ati awọn sẹẹli BRD4-miniSOG overexpressing HEK293T ni a palara ni awọn ounjẹ 10 cm.A fọ awọn sẹẹli pẹlu PBS tutu ati lysed ni 1 milimita Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) pẹlu inhibitor protease ti ko ni EDTA fun awọn iṣẹju 30 ni 4°C.Lẹhin iyẹn, a gba awọn lysates ni awọn tubes centrifuge 1.5 milimita ati centrifuged ni 15,871 xg fun awọn iṣẹju 10 ni 4 ° C.Supernatant ti jẹ ikore ati pe o ni idawọle pẹlu 5 µg ti anti-V5 ti a ṣe aami asin monoclonal antibody (CST, #80076) ni alẹ ni 4°C.Fọ isunmọ 50 µl ti amuaradagba A/G awọn ilẹkẹ oofa (MCE, #HY-K0202) lẹmeji pẹlu PBS ti o ni 0.5% Tween-20 ninu.Lẹhinna awọn lysates sẹẹli ti wa pẹlu awọn ilẹkẹ oofa fun wakati mẹrin ni 4°C pẹlu yiyi lati isalẹ si oke.Lẹhinna a fọ ​​awọn ilẹkẹ naa ni igba mẹrin pẹlu milimita 1 ti ifipamọ PBST ati sise ni 95 ° C fun iṣẹju 5.Awọn ayẹwo ni a ṣe atupale lori awọn gels SDS-PAGE ati gbe lọ si awọn membran PVDF ni lilo awọn ọna iwo-oorun ti o yẹ.Awọn membran naa ti dina ni 5% wara skim ni TBST ati pe a ṣe idawọle ni atẹlera pẹlu awọn ọlọjẹ akọkọ ati atẹle.Alatako Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) ni a lo ni ipin kan ti 1:1000 ni 5% wara skim ni TBST ati pe a fi sii ni alẹ ni 4°C.Anti-ehoro IgG ni a lo ni ipin kan ti 1:5000 ati pe a fi sii fun wakati kan ni iwọn otutu yara.Awọn membran ti wa ni wiwo nipasẹ chemiluminescence nipa lilo eto aworan Chemidoc MP.
Gbogbo awọn ẹya ti a lo fun Itupalẹ Agbegbe Wiwọle Iwadi Solvent (SASA) ni a gba lati Ile-ifowopamọ Data Amuaradagba (PDB)52 tabi aaye data igbekale Amuaradagba AlphaFold53.A ṣe iṣiro SASA pipe fun iyokù kọọkan nipa lilo eto FreeSASA.Ope nikan ati data SASA ti ko ni idaniloju fun akole histidine ati awọn aladugbo rẹ ni a lo lati gba SASA ti o tumọ si fun eto kọọkan.Wiwọle olomi-ara ibatan (RSA) fun histidine kọọkan ni a ṣe iṣiro nipasẹ pinpin iye SASA pipe nipasẹ iwọn agbara ti o pọju ti o ṣeeṣe ti agbegbe aloku ti o wa si epo.Gbogbo awọn histidines lẹhinna ni ipin bi pamọ ti o ba jẹ pe RSA ni isalẹ 20%, bibẹẹkọ ti farahan56.
Awọn faili aise ti a gba ni ipo DDA ni a wa ni lilo Proteome Discoverer (v2.5) tabi MSfragger (Fragpipe v15.0) ninu aaye data amuaradagba ti SwissProt ti o yẹ ti o ni awọn idoti ti o wọpọ.Awọn peptides nilo trypsin pipe pẹlu awọn aaye fifọ meji ti o padanu, carbamoyl methylation bi iyipada ti o wa titi ati oxidation methionine gẹgẹbi iyipada agbara.Precursor ati awọn ifarada iwuwo ajẹkù ni a ṣeto si 10 ppm ati 0.02 Da (MS2 Orbitrap), lẹsẹsẹ. A yọ awọn ikọlu eleti kuro, ati pe awọn ọlọjẹ ti yọkuro lati gba oṣuwọn wiwa eke ti <1%. A yọ awọn ikọlu eleti kuro, ati pe awọn ọlọjẹ ti yọkuro lati gba oṣuwọn wiwa eke ti <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфнфить. A yọkuro awọn ikọlu eleti ati awọn ọlọjẹ lati fun oṣuwọn wiwa eke ti <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены. A yọkuro awọn ikọlu eleti ati awọn ọlọjẹ lati ṣaṣeyọri oṣuwọn rere eke ti <1%.Fun itupalẹ pipo laisi lilo awọn akole, akoonu amuaradagba deede lati awọn atunwi ti ibi mẹta ni a lo.Onínọmbà isọdi subcellular Protein ni a ṣe ni lilo itupalẹ Gene Ontology (GO) lati ọdọ DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ati awọn apoti isura infomesonu ti a ṣajọpọ ati ti a tẹjade nipasẹ ẹgbẹ Alice Ting.Maapu onina ti a gba lati Perseus (v1.6.15.0). Awọn iyipada agbo opo amuaradagba ni idanwo fun pataki iṣiro nipa lilo idanwo t-apa meji, ati pe awọn ami amuaradagba jẹ idanimọ pẹlu iyipada lọpọlọpọ> 2 (ayafi bibẹẹkọ ti a sọ) ati p iye <0.05. Awọn iyipada agbo opo amuaradagba ni idanwo fun pataki iṣiro nipa lilo idanwo t-apa meji, ati pe awọn ami amuaradagba jẹ idanimọ pẹlu iyipada lọpọlọpọ> 2 (ayafi bibẹẹkọ ti a sọ) ati p iye <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Awọn iyipada agbo akoonu Amuaradagba ni idanwo fun pataki iṣiro nipa lilo idanwo t-tailed meji, ati awọn ibaamu amuaradagba jẹ idanimọ pẹlu iyipada akoonu> 2 (ayafi bibẹẹkọ ṣe akiyesi) ati iye ap <0.05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Iṣiro iṣiro ti awọn iyipada agbo ni akoonu amuaradagba ni idanwo nipa lilo t-igbeyewo meji-tailed, ati pe awọn ibaamu amuaradagba ti pinnu fun awọn iyipada akoonu> 2 (ayafi bibẹẹkọ ti tọka) ati awọn iye p-0.05.Onínọmbà ibaraenisepo amuaradagba ni a ṣe ni lilo itupalẹ GO pẹlu aaye data okun.
Awọn ẹda ẹda mẹta ni a ṣe pẹlu awọn abajade kanna.Ayẹwo iṣiro ni a ṣe pẹlu GraphPad Prism (software GraphPad) ati awọn igbero onina ni a ṣe pẹlu Perseus (v1.6.15.0).Lati ṣe afiwe awọn ẹgbẹ mejeeji, awọn iye p-ti pinnu ni lilo t-idanwo Ọmọ-iwe ti o ni tailed meji.Awọn ọlọjẹ ẹyọkan ti a mọ ni o kere ju lẹmeji ninu ẹgbẹ idanwo ni o wa ninu awọn igbero onina, ati pe awọn iye ti o padanu ni ẹgbẹ iṣakoso ni a rọpo pẹlu Perseus lati pinpin deede ki p-iye le ṣe iṣiro.Awọn ọpa aṣiṣe jẹ aṣoju iyatọ ± boṣewa.Ninu awọn itupale proteomic fun itupalẹ iṣiro, opo ti awọn ọlọjẹ ti o han ni o kere ju awọn ẹda ẹda meji ni idaduro.Awọn ọna iṣiro ko lo lati ṣaju-ipinnu iwọn ayẹwo.Awọn adanwo kii ṣe laileto.Awọn oniwadi ko fọju si awọn iṣẹ-ṣiṣe lakoko idanwo ati igbelewọn awọn abajade.
Fun alaye diẹ sii lori apẹrẹ ikẹkọ, wo Afoyemọ Ijabọ Iwadi Iseda ti o sopọ mọ nkan yii.
Awọn data spectrometry pupọ ti o gba ninu iwadi yii ni a fi silẹ si ProteomeXchange Consortium nipasẹ ibi ipamọ alabaṣepọ iProX57 labẹ dataset ID PXD034811 (dataset PDPL-MS).A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.Nkan yii pese data atilẹba.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gbigba lati mọ agbegbe: lilo biotinylation ti o gbẹkẹle isunmọ lati ṣe apejuwe awọn eka amuaradagba ati awọn ẹya ara map. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gbigba lati mọ agbegbe: lilo biotinylation ti o gbẹkẹle isunmọ lati ṣe apejuwe awọn eka amuaradagba ati awọn ẹya ara map.Gingras, AS, Abe, KT ati Raut, B. Imọmọ pẹlu awọn agbegbe: lilo biotinylation ti o gbẹkẹle isunmọ lati ṣe afihan awọn eka amuaradagba ati awọn ẹya ara map. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白僶质复合物制复合物列。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Loye agbegbe: lo igbẹkẹle agbegbe si igbesi aye ti ibi.Gingras, AS, Abe, KT ati Raut, B. Agbọye isunmọ: ijuwe ti awọn eka amuaradagba ati aworan agbaye ti awọn ẹya ara ẹrọ nipa lilo biotinylation ti o gbẹkẹle isunmọ.Lọwọlọwọ.Ero mi.Kemikali.isedale 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.Ṣiṣe aworan agbaye microenvironment nipa gbigbe agbara Dexter si awọn sẹẹli ajẹsara.Imọ 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.Awọn nẹtiwọọki iwọn-proteome meji ṣe awari atunṣe-pato sẹẹli ti ibaraenisepo eniyan.Awọn sẹẹli 184, 3022-3040.e3028 (2021).